出品：科普中国
制作：中国科学院宁波材料技术与工程研究所邢洁吴爱国
监制：中国科学院计算机网络信息中心
生、老、病、死，是自然界的规律。虽然目前我们仍无法改变生命终将消亡的结局，但从古至今人类从未停止与衰老，疾病做斗争的脚步。而近代医学的发展，更是极大地延长了人类的平均寿命。
医学的发展，是多学科参与的结果。例如物理学中的超声波、核磁共振现象用于疾病成像；化学中的放射性元素用于疾病造影成像诊断及放疗，和大量合成的化学药物；此外，包括基因筛查等大数据时代的疾病诊断与预测更是运用了数学中的分析与统计学方法。各种行业的人才经过共同努力、合作交流来促进医学技术的发展，才能在人类死亡宿敌面前取得先机。因此，今天我们向大家介绍一种有前景的多学科领域交叉的生物医学工具——光学成像探针。
光学成像，是以发光探针的发光强度为检测信号的可视化成像技术，主要包括生物发光技术与荧光技术两种。其中在荧光技术领域，基于荧光蛋白、以及基于荧光分子相关的超分辨荧光成像技术分别在2008年和2014年前后两次获得诺贝尔化学奖，可见荧光技术研究的重要性，实用性。一般来说，荧光技术主要是通过荧光探针的协助，对生物体进行标记。我们可以利用荧光成像灵敏度高，无创，实时等优势，对活体生物细胞活动或基因表达等生理变化，进行可视化的成像监测。荧光探针设计及成像技术的研究发展迅猛，已经广泛的应用于生命科学、发光成像指导手术、医学研究和药物开发等领域。
什么是荧光？
在日常生活中，人们通常把各种微弱的光都称为荧光，例如萤火虫、发光水母，夜明珠，荧光棒的光都属于广义的荧光现象。
而严格意义上的荧光定义，一般情况下指的是当某种常温物质吸收某种波长的入射光（通常是紫外线或X射线）能量后，进入激发态，并且在较短时间（10-7～10 -9 s）内发射出比吸收光能量低的长波长的出射光（通常波长在可见光波段），具有这种性质的出射光就被称之为荧光。
由于从入射光激发到出射光发射所用时间较短（纳秒级别），因此很多荧光物质一旦停止入射光，发光现象立即随之消失。另外有一些物质在入射光撤去后仍能较长时间（10-4～10s）发光（从激发态回到基态经过较为复杂的转换过程，辐射出光子），称为磷光。此外，还有一些物质入射光撤去后在更长时间（数个小时级别）内仍能够发光的现象，称为余辉。该过程更为复杂，例如夜明珠具有长余辉现象。
什么是荧光探针？
荧光探针是建立在光谱化学和光学波导与测量技术基础上，选择性地将分析对象的化学信息连续转变为分析仪器易测量的荧光信号的分子测量装置。
荧光探针受到周围环境的影响，在一定体系内，与某种物质发生化学或物理作用后，该分子的荧光信号能发生相应改变，从而使人们获知周围环境的特征或者环境中存在的某种特定信息。利用特定的分子探针信号变化与体内组织的本征形成对比反差，从而获得影像效果，荧光成像可以在体内展示出很高的空间分辨率。
荧光探针分子的结构如上图所示。一般来说，荧光探针由三个主要结构元素组成：荧光团（发光物质）、连接部分，与识别部分。
首先，识别部分主要保证探针的特异性和选择性，是疾病靶向性设计中最重要的组成部分。识别部分抗干扰性越高，信号就越准确。
其次，在荧光探针中荧光团作为信号发生部分，目前主要由无机荧光材料、有机类小分子荧光染料担任。无机荧光材料主要有稀土类荧光材料，包括具有代表性的镧系发光元素——铕(Eu)、钐(Sm)、铒(Er)、钕(Nd)等，和发光量子点如CdSe，CdTe等。有机分子荧光材料种类繁多，它们多结构易于调整，波长范围广泛，荧光探针常用荧光团有花菁类染料、罗丹明系列、香豆素及其衍生物、萘酰亚胺、氟硼二吡咯类以及AIE（Aggregation-Induced Emission）类荧光分子如四苯乙烯等。荧光团的激发和发射波长是探针设计中主要考虑因素。近红外（Near-infrared NIR）波长范围（700nm-1700nm）位于组织自体荧光范围之外，组织穿透深度可达5 - 10毫米。因此，几乎所有用于临床的光学成像剂都为NIR材料。目前有许多商业上可获得的染料覆盖了NIR波长的范围，并且研究证明波长越长越有利于提高信噪比。
最后，连接部分是连接识别部分与荧光团的桥梁，一般是碳链或者化学键。连接体可控制探针的整体大小，从而影响探针的整体性能如体内扩散速率、细胞渗透性和血浆循环时间等。
荧光探针的响应机理
（1） 光诱导电子转移机理（PET, photo-induced electron transfer）
在识别基团未与分析物结合之前，荧光团受光激发后激发态的电子不能跃迁到基态，使得荧光基团的荧光淬灭。而识别基团与被分析物结合后，PET过程受阻，荧光基团的荧光得以恢复。简而言之，就是探针与分析物质结合之前，探针不发光，结合后具有强烈荧光，因此我们可以根据荧光强度等参数从而分析判断被分析物。
（2） 分子内电荷转移机理（ICT, intramolecular charge transfer）
分子内电荷转移荧光的探针分子，通常是荧光团上同时连有推电子基团（电子给体，donor）和吸电子基团（电子受体，acceptor）,通过大π键提供电子转移的通道，形成强的推-拉作用的共轭体系，其吸电子基团或推电子基团本身充当识别基团的一部分。当识别基团和被分析物结合后，该部分的推拉电能力发生的改变，整个体系的的π电子结构重新分布，从而导致吸收光谱、发射光谱发生变化，主要是光谱红移或蓝移。因此这种探针主要根据光谱形状改变分析，来判断被分析物。
（3） 荧光共振能量转移机理（FRET, fluorescence resonance energy transfer）
荧光共振能量转移指的是一个荧光体系含有两个荧光团，一个充当能量供体donor，另一个为能量受体acceptor。当用供体的激发去激发荧光体系时，能够发生从donor到acceptor的非辐射能量转移，从而发射出受体荧光团的荧光。这种类型的荧光种探针分析物质时，主要是依据受体荧光团荧光变化。
荧光探针在生物医学中的应用
现在我们清楚了荧光探针发生信号变化的原理，那么它是如何运用到疾病成像诊断中的呢? 道理很简单，荧光探针能够针对多种分析物做出响应，那么当这些被分析物是各种疾病指标时，荧光随疾病指标而动，从而对相关疾病做出成像和诊断。
如图4所示，生物体注射靶向肿瘤微环境的探针后仅在靶向部位有信号响应，用于肿瘤检测诊断，制定合理的手术方案（小鼠乳腺癌模型活体成像）（组图A）；荧光探针可依据肿瘤的异质性选用肿瘤相关特殊靶点（例如蛋白酶，pH，能量代谢异常等），在手术中有效分辨肿瘤边界，用于术中导航，做到既不残留病灶，又能够减少正常组织被切除带来的痛苦（引导切除犬的肿瘤组织）（组图B）；此外，荧光探针还可以辅助组织切除后直观诊断病情发展状况，发光部分为异常组织（诊断为浸润性导管癌）（组图C）。
此外还有许多疾病模型的荧光探针研究，例如炎症模型（肝炎，关节炎）、阿尔茨海默症、糖尿病等。
相比于传统疾病检测技术，荧光成像方法具有高选择性、高分辨率、实时，创伤小，减轻患者诊断痛苦等优势。国家自然科学基金在荧光成像技术领域给予极大的支持，仅2017年荧光探针相关项目就达68项之多，可见其是一种极具前途的成像策略。
目前，相关领域的研究热点主要集中在提高成像深度及信噪比方面，最近许多科研工作者在国际顶级期刊就近红外长波长范围（＞1000nm）成像发表了研究成果。
参考文献：
[1] 分子发光分析荧光磷光—石河子大学药学院.
[2] M. Garland, J. J. Yim, M. Bogyo, Cell Chem. Biol. 2016, 23, 122.
[3] Q. Y. Gong, R. F. Zou, J. Xing, L. C. Xiang, R. S. Zhang, A. G. Wu, Adv Sci 2018, 5.
[4] J. Yang, X. Zhang, P. Yuan, J. Yang, Y. Xu, J. Grutzendler, Y. Shao, A. Moore, C. Ran, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2017, 114, 12384.
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