作为当下最受关注的生物技术之一，CRISPR 一直被认为有望未来在遗传疾病、癌症或者是 HIV/AIDS 的治疗上大放异彩。
现在，新的研究表明，CRISPR 可通过非病毒载体改进现有的细胞疗法。加州大学旧金山分校（UCSF）的科学家们成功使用非病毒载体在人类免疫细胞 T 细胞中插入了 DNA 片段，这不论在研究界，还是医学或者工业界，都开创了先河。
细胞疗法是通过基因编辑细胞，从而达到治疗疾病的目的。研究者们希望他们的这项快速、多功能以及经济的 CRISPR 基因编辑技术能够在基因和细胞治疗领域得到广泛应用，从而促进对肿瘤、自身免疫病以及其他疾病的新型安全疗法的开发。这项技术刊登于 2018 年 7 月 11 日的《自然》。
图丨此次的论文
非病毒载体终于出场！
从人类免疫细胞 T 细胞入手治疗癌症已经不是新的思路。
2017 年，制药巨头诺华和吉利德的细胞疗法 Kymriah 与 Yescarta 就被美国食品和药品管理局（FDA）批准，它们的治疗过程就包括提取免疫性T细胞，在实验室中对它们进行重新设计，然后再将它们放入患者体内。这样的疗法对于某些难以治疗的癌症来说，其治愈结果可能非常惊人。
不过，在这个方法被报道以前，上述疗法中，科学家们一般使用病毒载体向 T 细胞导入外源基因。
病毒载体的原理是，病毒可以感染细胞并将自身的基因组注射到细胞膜内。从上世纪 70 年代开始，科学家们就开发了这种载体技术，将外源基因导入到想要编辑的细胞中，应用的领域包括基础研究、基因治疗以及最近用于肿瘤免疫治疗的 CAR-T。
但是开发病毒载体较为困难，而且昂贵，并且能够利用的临床级别的病毒载体较少。不过，即使上述缺陷得到解决，病毒载体也并不是完美的，因为它们插入基因组的方式较为随意，这会导致细胞内正常基因组被破坏，或者是将外源基因插入到细胞调控机制不覆盖的地方，这些都会引起严重的副作用。
“为了将新基因导入到 T 细胞中，科学家们已经努力了将近三十年了，”这篇文章的第一作者 Theo Roth 说，他就读于 UCSF 医学研究训练项目（Medical Scientist Training Program），“有了我们的这个新技术，一个实验室六七位研究人员再也不用为了编辑 T 细胞一起改装病毒载体。而且如果数百个实验室可以开始使用这项新技术来编辑细胞，或者是攻克如何将复杂的长片段 DNA 导入细胞，这显然会加快细胞疗法的进程。”
图丨Theo Roth
更快更经济，编辑 T 细胞只需约一周时间
其中的关键技术主要依赖于“电穿孔（electroporation）”。电穿孔是利用电场刺激使得细胞膜通透性暂时增加的方法。研究者们发现，将适当的电场施加于一定比例 T 细胞、外源 DNA 以及魔剪 CRISPR 混合系统中，T 细胞就会将外源 DNA 和 CRISPR 吸收，接着魔剪 CRISPR 就会发挥作用，在某个特定的位置进行基因编辑。
但这个技术并未一开始就奏效。历经几乎一年数千次的试验和失败，Roth 和他的团队成员才找到了最适合的 T 细胞、DNA 数量以及 CRISPR 的比例，然后施加以适当的电场，就可以成功有效地编辑 T 细胞的基因组。
为了证实他的发现，Roth 利用 CRISPR 技术在 T 细胞中荧光（GFP）标记了一系列不同的蛋白，结果显示其可以特异性标记蛋白，并且脱靶效应较低——显微镜下只能看到特异性标记的亚细胞结构呈现 GFP 荧光绿色。
图丨研究人员将特定 CRISPR 导入 T 细胞中，这些 CRISPR 在 T 细胞内使得绿色荧光蛋白特异性表达于某些结构或区域
接着，为了证明这个方法能够实现治疗（多功能性和有效程度）的目的，Roth、 Marson 以及他们的同事们在自身免疫病和肿瘤中试验了用这种方法编辑后的 T 细胞。
在第一个试验中，未编辑的 T 细胞由耶鲁大学医学院的 Kevan Herold 医生所提供。这些 T 细胞是从患有一种罕见且严重的自身免疫病的三个兄弟姐妹体内分离的。这种自身免疫病非常顽固，对目前治疗自身免疫病的疗法都具有抗性。测序表明这些儿童体内的 T 细胞具有 IL2RA 基因突变。这个基因对于调节性 T 细胞（regulatory T cells, or Tregs）的某个膜蛋白受体具有重要的调控作用。调节性 T 细胞可以调控免疫细胞，是一类控制体内自身免疫反应性的 T 细胞亚群。
利用这项非病毒载体的 CRISPR 技术，UCSF 研究组很快就修复了这些 T 细胞 IL2RA 突变，并且还恢复了这个基因突变所导致的信号通路异常。研究者们采用类似 CAR-T 疗法的方法——即将 T 细胞从体内分离后进行编辑，然后再回输到体内——来治疗调节性 T 细胞缺陷的自身免疫病。
图丨Alex Marson。Spotlight Therapeutics 的共创始人，并且是 Juno Therapeutics 和 PACT Pharma 的顾问。Marson 实验室一部分基金来自 Juno, Epinomics，Sanofi 以及 Gilead Sciences
在第二个试验中，UCSF 研究组和 UCSD Parker 癌症免疫疗法研究院的 Cristina Puig-Saus 博士、Antoni Ribas 医生进行了合作。在这个试验中，科学家们成功地将体内分离的正常 T 细胞的受体用新受体替换，这个新受体可以识别黑色素瘤的某个特定的亚型。T 细胞的受体是 T 细胞用来识别病态或者被感染细胞的感受器。体外实验表明，改装后的 T 细胞可以特异性识别黑色素瘤细胞，而不攻击其他细胞。
即使不用病毒载体，研究者们也成功生产出了大量 CRISPR 重新编组过的能够表达新受体的 T 细胞。他们还证明当将这些 T 细胞转入到种植了人类黑色素瘤的小鼠时，它们被募集到了肿瘤区域，并且展示出了抗肿瘤效应。
“这种技术可以应用于替换任何 T 细胞受体，”Marson 说，他还是 UCSF Parker 癌症免疫疗法研究院和 Chan Zuckerberg Biohub 的一位成员，“有了这项技术，我们可以在任何特定位置剪切和插入基因。”
有望改变整个产业
Roth 特别提到，由于这项技术使得编辑 T 细胞只需要一周多一点的时间。以前由于病毒载体而觉得过于困难或过于昂贵的实验想法，现在都可以尝试着用这个新方法去实现。这就意味着，生物技术研发很可能因此迎来新的“物种大爆发”。
“我们会探索 20 个疯狂想法，”Roth 说，“因为我们可以快速生产出 CRISPR 模板。而且一旦我们有了模板，我们就可以将它导入到 T 细胞中。”
“这是一个非常快速、灵活的方法，可以改变、增强或者重新编码 T 细胞。这样，我们就可以把 T 细胞变成我们想要的样子，从而可以在对抗肿瘤、感染、自身免疫病中发挥重要作用。” UCSF 的 Alex Marson 如此说道。他是 UCSF 微生物学和免疫学副教授、海伦迪勒家庭综合癌症研究中心的成员，也是这个研究的通讯作者，“这些都是从未探索过的。”
在面对科学届公认病毒载体是必须的、只有少数 DNA 可以导入到 T 细胞的时候，Marson 和 Roth 表现出的超人的毅力显得难能可贵，最终推动了新方法的诞生。
研究人员也表示：“当我们能够找到适当的条件来克服这些困难的时候，我们就证明了我们的理论。Roth 付出了很多，费尽心思进行了数千种不同的试验，寻找 CRISPR 和 DNA 的比例、培养细胞的最佳方法、电场电流的大小等等。正是他对每一个参数都严格试验从而找到最佳条件，我们才收获了这个震惊的结果。”
