自新冠病毒肆虐以来，关于康复者二次感染、复阳 的案例屡见不鲜。此前医学专家普遍认为造成复阳的原因是人体免疫系统无法抵御冠状病毒的持续攻击。近日，MIT 分子生物学家 Rudolf Jaenisch 团队的一项研究揭示了另外一种可能。
该研究指出，SARS-CoV-2 RNA 可以逆转录并整合到人类基因组中。简单理解，就是病毒并没有在人体内消失，而是通过逆转录与人体 DNA 结合进行了隐藏，这可能是造成患者复阳的原因。
图 | 论文 “SARS-CoV-2 RNA reverse-transcribed and integrated into the human genome” （来源：bioRxiv）
目前，该研究论文发表在了预印平台 bioRxiv 上，一经上线就引发了业内激烈讨论。值得注意的是，对此研究的评论呈现出两种截然相反的态势，有专家认为这是一项 “颇具启发性的研究”，但也有观点质疑 “这项研究是否具有生物学意义”。
香港大学病毒学专家金冬雁教授就认为，这项实验是 “站不住脚” 的。按照实验的推论，如果 RNA 病毒可以通过逆转录整合进入人体 DNA，那么通过常见的流感就可能改变人体的基因。但实际上，现代医学还从未发现过流感病毒基因整合到人类基因组的痕迹。
SARS-CoV-2 RNA 可以逆转录并整合到人类基因组
起初，Jaenisch 团队是对感染新冠的患者初次痊愈后数周或数月核酸检测复阳的结果感到好奇。尽管有报道称复阳的原因是再次感染病毒造成的，但对痊愈者进行严格隔离措施后，仍然能够从他们身上获取到病毒信息，并且这些病毒并不具备复制属性和传染属性。
作为正链 RNA 病毒，SARS-CoV-2 和 SARS-CoV-1、MERS 等乙型冠状病毒一样，利用 RNA 聚合酶来复制基因组 RNA 及转录亚基因组 RNA。但从康复者的检测样本中未发现病毒的复制属性，研究人员由此推断出一种可能，SARS-CoV-2 RNA 逆转录并整合到人类基因组中，整合的 DNA 拷贝的转录可能导致 PCR 阳性的结果。
为证实上述推论，该团队通过体外细胞实验，利用新冠病毒和人体 LINE-1 逆转录酶或 HIV-1 逆转录酶，获得了三个发现：
感染培养细胞和（复阳）患者细胞中的嵌合转录物表达与病毒序列的基因组整合一致；
为了研究病毒转录、整合到人类细胞核中基因组的可能性，研究人员分析了 SARS-CoV-2 感染细胞的 RNA-Seq（转录测序）数据。通过对来自新冠确诊患者肺部、心脏、大脑、胃部及 BALF（支气管细胞灌洗液）等细胞样本的转录测序数据分析，发现大量样本细胞中都可能存在人体基因组及病毒基因的嵌合序列。
这些组合序列一般占总样本的 0.004% - 0.14%，其中来自重症新冠患者 BALF（支气管细胞灌洗液）细胞的组合序列高达 69.24%。
图 | cov2 嵌合读数在已发表的 RNA-Seq 数据集中可映射读取数比例
并且大部分嵌合序列 RNA 都来自 SARS-CoV-2 的核衣壳（N）序列。而核衣壳 (N) 是 SARSCoV-2 亚基因组 RNA 中含量最高的 RNA，因此最有可能成为逆转录和整合的靶点。研究人员认为，这些分析支持了 SARS-CoV-2 RNA 可能会逆转录整合到感染细胞的基因组中，并产生嵌合病毒 - 细胞转录物。
SARS-CoV-2 RNA 可以在过表达逆转录酶的细胞中逆转录并整合到人类基因组中；
为了进一步印证 SARS-CoV-2 RNA 逆转录和整合，研究人员在 HEK293T 细胞中过表达人体 LINE-1 或 HIV-1 逆转录酶，并用 SARS-CoV-2 感染转导细胞。
图 | SARS-CoV-2 RNA 可以逆转录并整合到宿主逆转录酶在细胞中的表达
考虑到核衣壳（N）RNA 是最有可能实现逆转录整合的靶点，研究人员选择了 4 套核衣壳（N）靶向 PCR 引物对纯化的细胞 DNA 进行扩增，并对细胞基因组 DNA 进行了凝胶电泳分析。研究人员不仅确认了核衣壳（N）序列，还从 CMV-LINE-1 过表达细胞的基因组 DNA （gDNA）中克隆出了全长核衣壳（N）DNA，并通过 Sanger 测序确认了其序列。
在感染的 2 天后，用 PCR 或荧光原位杂交检测细胞的病毒序列。结果证实，在同一组过表达 LINE-1 的感染细胞中，核衣壳（N）的信号比例（约 35%）明显高于未过表达 LINE-1 的感染细胞（约 12%）。转染 LINE-1 的感染细胞（约 80% 的转染效率）出现核衣壳（N）信号阳性的比例（约 30%）明显高于未转染的细胞（13%）。感染但未转染的细胞也表现出核衣壳（N）信号，尽管频率较低（约 10%）。
以上实验进一步证实，SARS-CoV-2 RNA 可以在体外被过表达的内源性逆转录酶逆转录。
SARS-CoV-2 RNA 和细胞能够诱导人体 LINE-1 表达，与逆转录整合相关；
人体内的 LINE-1 不仅是自主逆转录转座子，也有助于非自主元件的逆转录转座子。基于 LINE-1 的这一特殊性，研究人员发现，当感染 SARS-CoV-2 时 LINE-1 在 Calu3 细胞中的表达量上调了约 3-4 倍。此外，对 Calu3 细胞 DNA 的 PCR 分析显示，感染后 SARS-CoV-2 N 序列的逆转录整合，可能来自细胞因子激活的 LINE-1 逆转录酶。
图 | 在 SARS-CoV-2 感染和含细胞因子的条件培养基处理下，细胞系 1 作为内源性逆转录酶源在人类细胞中表达
虽然 LINE-1 在人体内基因组的占比达到 17%，但实际上其活性较低，50 万份拷贝中仅有 100 份处于活跃状态。为了研究细胞因子是否能够单独诱导 LINE-1，研究人员用含有细胞因子的培养基来培养骨髓细胞、小神经胶质细胞、CART 细胞，通过 PCR 分析发现内源性 LINE-1 表达上调了 2-3 倍。
研究人员还指出，LINE-1 表达在 SARS-CoV-2 感染后的细胞 RNA-Seq 数据中显著上调，与嵌合序列的丰度相关。也就是说，通过逆转录整合进入人基因组的新冠病毒序列可能是亚基因组片段，因为整合序列大多集中在核衣壳（N）附近，因此也不具备感染性。
Jaenisch 团队表示，实验证实了 SARS-CoV-2 RNA 可以通过逆转录酶逆转录并整合到人类基因组中；并且 LINE-1 的表达可在 SARS-CoV-2 感染或暴露于细胞因子后被诱导，表明了 SARS-CoV-2 在患者体内逆转整合的分子机制；整合的片段最有可能是 SARS-CoV-2 亚基因组片段。SARS-CoV-2 RNA 逆转录解释了病毒暴露后，在没有检测到传染性病毒的情况下，为何病毒序列仍然存在。
研究引发热议，真实体内情况不支持实验结论
研究人员总结认为，如果 LINE-1 序列在人体细胞中自然产生 RT（逆转录酶），那么确诊感染新冠的患者身体里可能已经发生了病毒与 DNA 结合的情况。除此之外，对于同时感染了新冠和艾滋的患者来说，体内可能也已经发生了这种整合变化。
该实验为核酸检测不到患者体内病毒的残留提供了一种可能性的分析。与此同时，也对目前依靠 PCR 检测新冠及治疗方法有效性提出了一些担忧。
图 | 新冠病毒 （来源：Science）
“目前仅发现逆转录病毒以及与之类似的乙型肝炎病毒能够把核酸整合到宿主 DNA 中。逆转录病毒必须通过整合才能不断复制并组装新的病毒，但新冠病毒并不是逆转录病毒。在 MIT 的这项实验中，从细胞外人为地加入过量的逆转录酶，才导致 RNA 逆转录成为 DNA 的结果。但实际上，人体细胞中并没有这么多的逆转录酶，所以这个实验更偏向一种‘假说’，与人体细胞内的真实环境与可能出现的实际情况有很大出入。” 金冬雁教授告诉 DeepTech。
中国医学科学院研究员、原北京协和医学院教授王晨光也指出，新冠病毒和逆转录病毒在感染宿主后的行为有本质的区别。逆转录病毒相当于病毒劫持了宿主，并把自己变成了宿主身体内的一份子。而新冠病毒在感染宿主细胞后，不像逆转录病毒那样 “反客为主”，病毒核酸在宿主细胞中只能进行复制和蛋白质得以表达产生，最终完成病毒颗粒的组装。
大家熟知的典型逆转录病毒还有 HIV，它可以通过自身 RNA 产生酶进行逆转录变成 DNA，再通过不断复制融合进入人体的基因组。而新冠病毒是通过 RNA 聚合酶完成复制，中间不会有逆转录到 DNA 的过程。此外，新冠病毒的复制过程都是在细胞质里完成的，而 DNA 主要集中在细胞核之中，所以新冠病毒的复制过程并不会触碰到 DNA。
实际上，在人类进化过程中，已经有大量的病毒或细菌 RNA 整合进入人体 DNA，但大多数的整合基因组都被证实是没有任何功效的。
尽管质疑声不断，也有部分专家学者对该实验给予了肯定。《科学》杂志援引美国著名病毒学家、艾滋病毒发现者 Robert Gallo 评论称，虽然对实验的完整性持怀疑态度，但我非常喜欢这项研究，我猜实验是正确的。
值得注意的是，针对该实验及衍生的疫苗讨论正不断升级。有学者指出 “病毒 RNA 可以逆转录整合进入人体 DNA，那基于蛋白合成的 mRNA 疫苗也可以通过逆转录整合进入人体 DNA，这将导致注射疫苗后的人类基因被改变。”
金冬雁向 DeepTech 解释了 mRNA 的特性，首先 mRNA 寿命很短暂，从几十分钟到几小时不等。而且 mRNA 在体内体外都很容易碰到 RNA 酶而被降解，哪怕人体的汗液、眼泪和唾液都有 RNA 酶。所以 mRNA 疫苗要放在零下 70°C 才能保存其活性。其次 mRNA 进入的细胞也是有寿命的，会自然死亡。针对新冠病毒抗原的抗体和免疫细胞形成后，也会帮助人体彻底清除带有 mRNA 疫苗的细胞，所以这些细胞不可能一直停留在身体内，根本不会导致所谓的疫苗逆转录为 DNA 造成基因改变。
王晨光也指出，mRNA 核酸疫苗仅仅包含病毒的一个编码蛋白的核酸序列，其病毒核酸物质既不能被整合到人体基因组 DNA，也不能在细胞内复制扩增。细胞不仅没有被劫持，反而利用 mRNA 合成的蛋白质装备了一只武器精良的雇佣军来防范新冠病毒。
虽然整个实验过程缺乏直接性证据证明新冠患者体内的病毒整合进入了 DNA，这也是很多学者诟病此项研究的主要原因，但这种假设确实为病毒研究提供了一定的价值，尤其是为未来防范、规避 RNA 病毒风险的时候。不放过每一种可能，大概就是生物学最大的魅力。
澳大利亚国立大学约翰柯廷医学研究院，遗传与表观遗传方向博士生张旌对本文亦有贡献
