编者按：
牛津纳米孔技术公司（ONT）的目标是 “让任何人都可以随时随地进行基因分析”。实际上，牛津纳米孔技术公司（ONT）的测序仪已经推广至 80 个国家地区。并且，该技术支持了 2016 年利比里亚爆发埃博拉疫情期间的病毒诊断测试，同时还可用于建立新人类参考基因组项目。
那么未来纳米孔测序技术将如何继续发展？今天我们特别编译了发表在Genetic Engineering & Biotechnology News杂志上关于纳米孔测序技术的文章。希望本文能够为相关的产业人士和诸位读者带来一些启发和帮助。
① 疯狂的想法
2014 年 6 月，英国伯明翰大学微生物学教授 Nick Loman 博士在 Twitter 上发布了使用革命性新型测序仪收集的第一批数据。
Nick Loman 博士用“波浪图”形象地展示了，当 DNA 链快速穿过通道时，电流是如何随时间变化的。并且，Loman 博士的课题组将图中的“峰”和“谷”成功转换为铜绿假单胞菌的 DNA 序列。
Loman 是便携式 DNA 测序仪 minION 的早期拥护者。minION 是英国牛津纳米孔生物技术公司（ONT）生产的第一台仪器。
Loman 发表的这条 Twitter 距离加利福尼亚大学圣克鲁斯分校生物分子工程学教授 David Deamer 提出纳米孔测序概念已经近 25 年。
Deamer 教授回忆称，在 1989 年 6 月，脑中忽然涌现出灵感——如果 DNA 链在一定电压下通过膜通道会产生什么现象呢。从此，他就对开始了对纳米孔测序的深入探索之旅。
当时，哈佛大学医学院的基因组科学家 George Church 博士也在研究类似的课题。几年后，在 1995 年，Deamer 和 Church 连同哈佛大学生物学博士、名誉教授 Dan Branton 等人，将他们的想法申请了专利。
当时哈佛大学专利局的 Branton 认为：“这真是个疯狂的主意。它永远都行不通的。” 然而，事实证明，Church 的提议具有足够的说服力。哈佛大学批准并向授予专利的美国专利局提交了申请。
图.1989 年，David Deamer 教授写下的笔记。
② 实现愿景
2005 年，牛津大学化学生物学教授 Hagan Bayley 博士成立了 Oxford Nanolabs，即 ONT。Gordon Sanghera 博士被聘为创始 CEO。参与公司创立的还有当时在 IP 集团工作的 Spike Willcocks 博士，现在是 ONT 的首席 BD。
在距 Bayley 实验室仅几个街区的牛津的一家酒吧喝酒时，Sanghera 获得了 IP 集团公司的第一笔重大投资——50 万英镑。
直到 2012 年 2 月，在佛罗里达州马可岛的 AGBT（Advances in Genome Biology and Technology，基因组生物学与技术新进展）高端会议上，ONT 的首席技术官 Clive Brown 在题为“Single Molecule ‘Strand’ Sequencing Using Protein Nanopores and Scalable Electronic Devices”的演讲中介绍了 MinION。
“使用蛋白质纳米孔和可扩展电子设备进行测序。” Brown 曾在英国 Solexa 下一代测序（NGS）公司（2007 年被 Illumina 收购）任职。所以他的任务就是，以某种方式推翻他之前帮助建立的技术，而这一传统测序平台已经占领了 NGS 市场的很大份额。
ONT 的竞争对手不仅包括 Illumina，而且还包括 Pacific Biosciences 和 MGI 以及刚进入测序领域的初创公司。令人兴奋的是，PacBio 公司长而准确的 HiFi 测序以及 MGI 带有 CoolMPS 化学技术的新测序平台正在孵化中，后者声称可以提供仅需 100 美元的基因组（在今年举行的 AGBT 高端会议上宣布，即大流行之前）。
自 2012 年以来，ONT 的技术有了长足的发展。除了拥有最多 512 个纳米孔通道的袖珍型设备 MinION 外，ONT 产品阵容还包括更大的 GridION，这是一款紧凑的台式设备，旨在运行和分析多达五个 MinION 流通池（flow cells），以同时生成多达 150 Gb 的数据。
对于更大的需求和应用，ONT 开发了 PromethION 台式系统，是 ONT 最高吞吐量的定序器，具有 48 个流通池，能够生成多达 8 Tb 的数据。
Flongle 是一种新产品，是 MinION 或 GridION 的适配器，可使这些仪器更快、更便捷的完成一些较小的测试和实验。
生物信息学顾问 Albert Vilella 博士表示，ONT 在最近的更新中透露，使用 Flongle 流通池可以以 100 美元完成实验，这将成为“游戏规则改变者”，并意味着会有越来越多的人采纳 ONT 技术。
Villela 断言，届时将没有竞争对手能够以这种价格进行技术部署。
ONT 即将推出的 Plongle，本质上是一种与 96 孔板兼容的 Flongle，可以并行进行大量小型的快速测试。
而仍在开发中的 SmidgION 将成为 ONT 迄今为止最小的设备，专为智能手机或其他低功耗移动设备而设计。
在 ONT 成立的 15 年后，它遇到了另一个机遇，可以让其充分发挥其潜力。长期以来，Sanghera 一直表示，ONT 传感器以快速读取 DNA 能力方面见长，例如针对糖尿病患者的针刺试验。COVID-19 大流行恰巧提供了这样的机会。
图.牛津纳米孔技术公司的 Gordon Sanghera 博士。
③ 从生成序列到诊断
在今年 8 月初高调发布之后，ONT 决心在 COVID-19 的诊断产生一定的影响力。因为 COVID-19 是一种流行病，迫使学术界科学家和商业公司与时间赛跑，加速创新。ONT 宣布与英国卫生与社会护理部达成协议，推出了 COVID-19 测试试剂盒 LamPORE。
LamPORE 主要用于处理拭子和唾液样品。一台 MinION 最多可以容纳 1500 个粘贴有条形码的患者样品，并在大约 90 分钟内完成运行。
Sanghera 表示：“LamPORE 具有高效完成检测的潜力，此外至关重要的一点是，其测试解决方案向全球开放。不仅适用于 COVID-19，而且还适用于多种其他病原体。”
LamPORE 融合了两个操作过程，即 LAMP 环介导的等温扩增和纳米孔测序。LAMP 是一种维护成本相对较低的 DNA 扩增过程，具有较高的特异性和效率。在恒温条件下，用单个试管就能完成，价格很便宜。
LAMP 一开始是由一群日本研究人员在 20 年前开发出来的。由于其在 COVID-19 诊断方面的适用性，最近 LAMP 技术再度火爆市场。其他研制 COVID-19 诊断技术的公司包括 Color、Sherlock Biosciences 和 STOPCovid，也依靠 LAMP 进行扩增。
扩增后，LamPORE 使用纳米孔测序来鉴定 SARS-CoV-2 病毒的三个基因。该方法可以鉴定是真实存在病毒还是扩增过程中发生的错误——假阳性结果的主要来源。此外，该测试还引入了人类 mRNA 的内部对照，以识别样品采集中的错误（如，无效的咽拭子）——假阴性结果的主要来源。
除了 SARS-CoV-2，ONT 还在继续开发 LamPORE，以用于测试单个样本中的多种病原体，包括 A 型流感（H1N1 和 H3N2）、B 型流感和呼吸道合胞病毒。正如资深基因组学博主Keith Robison 博士所写的那样，“呼吸道病毒检测的广泛部署和使用，可能是流行病笼罩中一线微弱的曙光。”
LamPORE 之所以能让人们如此兴奋，很大程度取决于其可扩展性，可以快速完成对抗疫一线工作者和机场、疗养院和学校等地区的筛查。LamPORE 的合规性申请已经提交，正在等待批准。
图.牛津纳米孔技术公司的 Clive Brown
④ 动态改变序列
自适应测序（Adaptive sequencing，一种选择性测序）根据是否存在目标序列，在测序过程中建立一个决策点。如果存在目标序列，则继续测序；相反，电压反转，弹出 DNA 链，释放出纳米孔以允许新链进入。该决策是通过将 DNA 序列与目标参考序列进行匹配来确定的。
通过借助这项技术，研究人员无需进行前期准备或富集样品，即可进行选择性测序。通过实时控制孔电压，可以全程观察测序的动态变化。
约翰·霍普金斯大学计算机科学与生物学副教授 Michael Schatz 博士表示，在传统测序过程中，有很多数据可能是冗余的，也可能来自基因组的无关区域。Schatz 指出：“自适应测序改变了这一切，因为它可以选择性地瞄准与目标相关的序列。”
Schatz 继续解释道，“Killer 应用”是针对靶向测序开发的，即研究人员只对某一组特定的基因感兴趣时。
当 Schatz 实验室的研究人员使用自适应测序法靶向 148 个与遗传性癌症相关的基因时，他们能够使用一个流通池完成基因测序，而不再需要标准的 5 个或 6 个流通池。
Schatz 指出，自适应测序在宏基因组学中有广泛的用途，可以对感兴趣的基因组进行选择性测序，并富集低丰度的物质。最后，Schatz 指出，他们目前正在努力将自适应测序技术扩展到 cDNA 和 RNA，以实现转录本的选择性测序。
Schatz 说，他可以预见到未来某一天，“所有的纳米孔测序都将使用自适应测序进行 DNA 和 RNA 测序。”
⑤ 重新定义“长”
长读测序的一大优点（ONT 和 PacBio 的优点）是能够读懂复杂的、高度重复的 DNA 区域。尽管自人类基因组计划完成以来，测序技术有了巨大的进步，但科学家们一直无法完成整条染色体从头到尾的连续序列的测序，直到国际端粒到端粒联盟（T2T）接手后才获得完整的染色体基因序列。
T2T 是一个开放项目，用于研究人类基因组的第一个完整参考序列。T2T 联盟由加州大学圣克鲁兹大学基因组学研究所助理研究员 Karen Miga 博士和美国国家人类基因组研究所计算生物学和基因组信息学部的 Sergey Koren 博士和 Adam Phillippy 博士领导。
去年 7 月，T2T 在《自然》杂志上，报道了首个端粒到端粒的无缺口人类 X 染色体图谱。
组装完整染色体的一个最困难的一点在于，如何完成重复 DNA 区域的组装。为了回答“高覆盖、超长读测序是否能够解析人类基因组的完整组装”这一问题，Miga 和同事建立了 T2T 联盟。
尽管纳米孔测序是生成完整基因组（从葡萄胎 CHM13）的高覆盖度、超长读取序列的核心，但是该团队还借助了多平台技术（包括 PacBio、Illumina 平台），同时融合了多种用于质量改进和验证的技术（10x Genomics 的抛光技术和 BioNano Genomics 的光学地图技术）。
该项目是在单倍体基因组上进行的，但 Miga 小组将研究重点转向二倍体样品。Miga 在 2019 年伦敦电话会议上指出：“过去，我们一直使用的是具有数百个缺口的不完整的人类参考基因组。” T2T 的目标就是将基因组学的标准转移到完整性和质量上。
Miga 断言人类正在进入一个新时代，“需要完整，高质量的染色体组装体”。如果真是这样的话，那么 ONT 在下一代测序中所发挥的作用将很有趣。
原文链接：https://www.genengnews.com/topics/translational-medicine/nanopore-sequencing-looks-to-the-long-haul/
作者｜Julianna LeMieux
编译｜ninety
审校｜617
