2020年9月7日，新冠灭活疫苗在中国国际服务贸易交易会首次公开亮相，中国生物与科兴两家公司工作人员透露，高等级生物安全生产设施正在建设，预计新冠疫苗可以于2020年年底上市，两家公司的年产能均为3亿支[2]。3亿体现着在疫情抗击面前的中国力量和中国速度，那么这些疫苗是通过怎么样的方式大批量生产出来的呢？本文将简要介绍疫苗是如何从车间生产出来的。本文将介绍介绍疫苗是如何从车间生产出来的，总字数3375，阅读约11分钟。
撰文 | 季静远
编辑 |徐介晖、周圣钧、高松龄
审核 |赵鑫、张可人
来源：探臻科技评论
图片来源：郑筱倩, 卢艳艳. 揭秘甲型H1N1流感疫苗生产过程[J]. 科学之友(A版), 2009.
01 大规模生产前的准备
疫苗的开发分为三个主要阶段：实验室内的抗原发现，用于临床的小规模生产工艺开发（中试）以及供全球使用的大规模的疫苗生产，整个流程如下图所示[3]。
图1.疫苗从实验室研发到大规模生产的流程[3]
从实验室方法到工业生产过程的转变需要对疫苗生产方法进行基于科学，技术，法规以及实施方法的改进，整个过程需要涉及多个领域的知识，此过程极为困难并且可能发生许多的失败。建立稳定的，可重复的生产工艺是成功长期供应疫苗的关键。工艺开发，设备选择和设施设计决定了疫苗生产工艺，而且这一工艺必须满足动态药品生产管理规范（Current Good Manufacture Practices，cGMP）。
02 大规模生产的普适流程
建立工作种子库：为确保每批原料相同，所有生物过程均始于认证的种子库系统中的分装，再用于微生物，动物细胞或病毒。
培养：在一系列体积逐渐增加的生物反应器中发酵产生所需数量的细胞以产生产物。在病毒过程中，细胞通常生长至最大密度，然后被病毒感染并维持最大程度的病毒生产。
收获：使用错流或末端过滤或离心将活性疫苗中间体从生长培养基中分离出来。
纯化：活性疫苗中间体通过过滤和色谱法纯化。
批量填充：将纯化的疫苗中间体配制成最终有效成分，然后装入适当的无菌批量容器中。
最终产品的填充和包装：将配制好的疫苗装入注射器，小瓶或其他最终递送容器中，必要时冻干，贴标签，包装并准备好运送到最终目的地。整个流程虽然曲折，但是当这一大规模生产过程完善之后，将以一种极具经济效益的方式生产数亿剂疫苗。整个大规模生产的流程如图2所示：
图2.疫苗的大规模生产流程[3]
03 大规模生产的不同技术路线
具体地，疫苗的制造可分为基于细胞培养、基于微生物和基于卵基载体等三种技术路线，下面逐一进行介绍：
大规模生产方法Ⅰ：基于细胞培养的疫苗生产
可以在具有适当培养基和受控操作条件的生物反应器中使动物细胞大量增殖。细胞生长所需的所有营养物质在培养基制备罐中与高度纯化的制药级水混合，然后进行灭菌并转移到生物反应器中。净化水和其他工艺设备的生产是任何制造工厂的重要组成部分。将来自细胞库的细胞接种物放入第一个种子发酵罐中以启动该过程。
动物细胞在生物反应器中的生长是一个困难而严峻的过程，需要具有精确操作变量控制和绝对无菌性的设备。由于设计不足而导致的设备故障是制造故障或中断的最常见原因。一旦细胞数量增加了5-10倍，细胞就会转移到下一阶段，进入生产生物反应器，在那里，细胞又增加了5到10倍。通常，会有一系列的发酵罐，每个发酵罐都比以前的发酵罐大5至10倍。那么为什么一次最多只能扩增10倍细胞呢？原因是10倍的扩展倍数可以兼顾经济效益和技术难度；扩增倍数如果较小，则会增加资本成本，如果较大，则会增加技术难度。到细胞生长步骤结束时，细胞总数已增加了数千倍。
在最后的生长步骤中，用含有所需抗原的转基因病毒感染生物反应器中的细胞，并使该病毒繁殖。在病毒生长周期结束时，将生产生物反应器的内容物进行离心或过滤，以将细胞与上清液分离。细胞或上清液都将包含病毒。产品存放在收割储罐中以进行进一步处理和错流过滤将病毒与大多数细胞代谢产物分离。
通过色谱分离或错流过滤从大多数细胞代谢物中分离出病毒，从而可以进行病毒纯化。通常，在此步骤中需要大量的缓冲液，工艺开发的目的之一是减少工艺要求，以最低的总成本获得所需的纯度。病毒纯化后，将活性疫苗中间体配制为最终成分，并准备批量填充到无菌转移容器中。然后将散装疫苗中间体储存起来，然后进行最终填充和包装。设备周转需要自动清洁周期和批次间的维护。
图3 基于细胞培养的疫苗生产[3]
大规模生产方法Ⅱ：基于微生物的疫苗生产
微生物的产生与细胞培养非常相似，但严格程度低于细胞培养。将含有无菌培养基的种子发酵罐接种含有合适抗体基因的重组微生物细胞，并对其进行控制以促进最佳的微生物细胞生长。动物细胞培养和微生物细胞生长之间的重要区别在于，微生物细胞通常需要更多数量级的搅拌和通气，从而大大改变了发酵的性质。细胞以一系列10倍的步骤繁殖，从而在生物反应器中完成生产。
培养结束时，将细胞代谢产物进行离心分离，以将产品与培养基和其他残留物分离。针对疫苗必需物质，将其回收，清洗并送至大批灌装。在另一个可能的过程中，在均质器中处理细胞以释放靶质粒或蛋白质。然后将来自均质器的裂解细胞糊状物与合适的缓冲溶液重悬在裂解物储存罐中，然后通过错流过滤从裂解物中去除残留的细胞碎片。培养产物，rDNA或蛋白质疫苗中间体应先在色谱柱中纯化并储存在澄清的反应罐中。然后将纯化的产品填充到传输容器中，并在最终填充和包装之前进行存储。
图4 基于微生物的疫苗生产[3]
大规模生产方法Ⅲ：卵基载体的疫苗生产
在这个过程中，鸡胚成纤维细胞（CEF）被用作宿主细胞来寄生抗原。由卵产生抗体的主要问题是无菌控制。鸡蛋来自非无菌环境，并且很难在没有偶然污染的情况下打开。唯一的保护措施就是无菌技术以及设施和环境的质量，所有的流程都需要在洁净室中进行无菌操作：这些流程的设施，人员和培训密集，难以维护且操作成本高。
这种情况说明了生产中的经典难题：尽管鸡蛋似乎很便宜，并且可以提供较低的运营成本，所需的大型优质设备，较高的运营费用，规模经济的可能性以及相对较高的频率批处理失败的成本以及成本的组合使人们怀疑是否可以实现明显的节省。在实验室水平上，基于发酵罐和细胞培养的操作似乎更为复杂和昂贵，但在大规模生产时，成本多为固定成本，经济效益更高，失败率更低，从而降低单位产量的制造成本。
此过程始于在高度专业化的鸡群和设施中生产的受精特定无病原体卵（SPF卵）。SPF鸡肉和鸡蛋的大小尚未估计出与所需疫苗数量相适应的生产设施，但是，全面设施可能需要约2000万个鸡蛋/年。SPF鸡蛋被运送到生产设施，进行可行性检查和消毒。
从表面消毒过的鸡蛋中收获鸡胚。将胚与胰蛋白酶一起孵育以分离CED细胞，然后通过离心从滤液中回收CED细胞。所有这些操作都是手动操作，并且在B级环境中的生物安全罩中进行。回收的CED细胞在滚瓶中被病毒种子感染，并在温暖的房间中孵育。细胞不会在该系统中生长，但是病毒会繁殖。在温育期结束时，收获细胞和病毒并离心以开始纯化过程。破碎回收的细胞以释放靶病毒颗粒，然后通过离心澄清和纯化。制备批量配制的疫苗，并在无菌条件下装入转移容器。所有这些操作均在B级环境中在无菌条件下进行。
图5 卵基载体的疫苗生产[3]
04 大规模生产的后续处理
在疫苗完成生产之后，灌装与包装也是非常昂贵且占用空间和劳力的活动。在设施规划方面，这是一个非常重要的考虑因素：填充和包装空间是洁净室空间，并且建造和运营非常昂贵。在分装后的储藏过程中，要根据不同疫苗品种的储藏要求，设置相应的储藏设备，如低温冰柜 、电冰箱、冷藏柜和液氮灌等。所有疫苗都应储藏于冷暗、干燥处，避免光照直射和防止受潮。运输疫苗时,要妥善包装，防止运输过程中发生损坏。冻干活疫苗应冷藏运输。如果量小，可将疫苗装入保温瓶或保温箱内，再放人适量冰水块进行包装运输；如果量大，应用冷藏运输车运输。灭活疫苗宜在2至4℃的温度下运输。夏季运输要采取降温措施，冬季运输要采取防冻措施,避免冻结。细胞结合型度苗如马立克氏病血清I、II型疫苗必须用液氮 (-196 ℃) 冷冻运输。运输过程中，要随时检查温度，尽快运达目的地。疫苗运输时应严格按照疫苗贮藏温度要求进行运输并且尽快运输。在所有运输过程中,必须避免日光暴晒[6]。
05 结语
用人工免疫方法预防和控制传染病，是数百年来人类在同传染病斗争过程中所取得的突出的成就[4]。疫苗开发涉及多个平行途径，从实验室到有功效证明的产品开发是一条途径，从实验室方法到中试工厂研究再到制造设施设计和启动的过程开发是另一途径。我国新冠疫苗的研发是采用了两条途径同时进行且每日24h工作三班倒的形式进行疫苗开发，从建设开始到落成共经历60天。得益于上述提到的疫苗大规模生产技术，疫苗成本将会大幅度降低，中国生物表示，定价将会按照“公共产品”、分类定价、可及可负担的原则，让老百姓用得起，用得放心[2]。
参考资料
[1] 郑筱倩, 卢艳艳. 揭秘甲型H1N1流感疫苗生产过程[J]. 科学之友(A版), 2009.[2] https://www.thepaper.cn/newsDetail_forward_9065043
[3] Pisano, G.P. (1997). The Development Factory. Harvard Business School Press, Boston, MA.Vaccine Scale-up and Manufacturing
[4] 杨勇, 张垚, 暴学奇. 疫苗中试车间工艺设计分析[J]. 化工与医药工程, 2017(01):32-35.
[5] 毛华. 动物疫苗的储藏和使用方法[J]. 当代畜禽养殖业, 2015, 08(8):53-53.
作者简介：季静远，机械工程系博士生三年级，导师孙伟教授，研究方向：组织工程与药物递送，长期关注生物制造等领域。
本文经授权转载自微信公众号“探臻科技评论”。
