近年来，随着共刺激和共抑制机制的发现，以及免疫检查点抑制剂在临床上的巨大成功，肿瘤免疫治疗迎来了划时代的变革。尽管如此，仍然只有 20% 左右的患者和部分肿瘤类型受益，寻找新的免疫疗法和联合治疗方法迫在眉睫。
追根溯源，人类历史上第一款肿瘤免疫疗法应属于 1986 年 FDA（美国食品药品监督管理局）批准的用于治疗 HCL (hairy cell leukemia, 毛细胞白血病)的药物——IFNα（干扰素 -α）。一型干扰素是重要的抗病毒细胞因子，同时也兼具抗肿瘤的效果。自此，细胞因子叩开了肿瘤免疫疗法的大门。
随后，高剂量重组 IL-2（白细胞介素 - 2）分别于 1992 年和 1998 年被 FDA 批准用于治疗转移性肾癌和转移性黑素瘤。IL-2 作为一款明星抗肿瘤治疗手段，其肿瘤整体反应率高达 15% 左右，被赋予厚望，至今仍然在临床上被广泛研究和应用。但由于细胞因子的半衰期短、需要长期给药和严重副作用等难以克服的问题，IFNα很快被嘌呤类药物代替了治疗 HCL 一线药物的地位，而 IL-2 也逐渐被搁置，细胞因子在肿瘤免疫疗法上的应用也逐渐淡出了人们的视线。
2020 年 6 月 24 日，一篇发表在 Nature 上的论文：IL-18BP is a secreted immune checkpoint and barrier to IL-18 immunotherapy，又将细胞因子疗法拉回了大众的视野。论文指出，利用定向进化等技术将野生型 IL-18（白细胞介素 - 18）改造为 DR-18 (decoy-resistant IL-18)，可以让其具有不被它的天然抑制剂 --IL-18BP 所抑制且可以继续转导信号的功能，在小鼠肿瘤模型中发挥了强大的抗肿瘤作用，也暗示了 IL-18 在肿瘤免疫疗法中的潜力。
近日，生辉与此篇论文第一作者耶鲁大学周挺博士一起探讨了细胞因子在肿瘤免疫疗法中的“过去与未来”。
图 | 耶鲁大学周挺博士（受访者提供）
突破，主要是对靶点的选择
生辉：为何选择细胞因子作为抗肿瘤免疫治疗手段？
周挺：细胞因子是一个典型的矛盾复合体。它一方面天然的具有抗肿瘤的潜力：细胞因子作为一种小的、可溶性的信号蛋白，调控着免疫细胞及其相关细胞的生长、发育、分化和效应功能，这些功能对于免疫系统和免疫细胞在对抗病原菌入侵和肿瘤的过程中至关重要。但另一方面，细胞因子因其多能性 (pleiotropic)、冗余性 (redundant)、不同的产生来源 (resource) 和作用终端 (destination)，以及其作用的多种方式 (autocrine, paracrine & endocrine)，编织了一张复杂的细胞因子网络。同时，细胞因子的高效性让自然进化了严格的负调控机制，大大削弱了其生物学功能。这些因素导致细胞因子治疗容易产生各种副反应，药物耐受度低和高毒性，使得细胞因子又不 “天然” 的适合作为可以利用的药物靶点。
近年来，利用精确的 “设计” 和改造细胞因子从而去除其不利的生物学特性，为该领域开辟了新的方向。我所使用的起始研究工具，定向进化和酵母展示，正是这个新方向的推手。定向进化和噬菌体（酵母）表面展示技术曾获得了 2018 年的诺贝尔化学奖，是一项强大的蛋白质工程手段，同时也是一种重要的基础科学研究工具。通过这个工具，可以把细胞因子改造成只跟某一种受体结合，而不跟其他受体结合，同时结合亲和力提升，从而放大它在这个信号通路中的输出表型，使其与其他信号通路区分开来。这些具有激活特定通路的偏好激动剂（partial agonist）不仅能厘清细胞因子在复杂网络中的每条信号通路的具体生物学功能，解决 “多能性” 和“冗余性”等问题，同时也成为了候选药物。
生辉：在众多细胞因子中，为何挑中了 IL-18？
周挺：我的导师在他博士期间曾经开发了两个在概念上有创新突破的细胞因子靶点：CD122 偏好的 IL-2(super-2)用来避开调节型 T 细胞从而特异激活肿瘤杀伤 CD8 T 细胞，以及 SIPRα高亲和力突变体用来阻断巨噬细胞上的 CD47 靶点。但在后续临床前研究中效果并不突出，因此我们仍然想在这条路上深挖下去。我们在挑选细胞因子时的前提假设是，它必须是特异作用于肿瘤微环境中的，这样可以避免它非特异性的系统的激活全身免疫细胞而导致高毒性。2016 年哈佛大学 Ana Anderson 和 Vijay Kuchroo 两个课题组在 cell 上发表了一篇文章，他们利用单细胞测序结束结合新开发的分析方法详细剖析肿瘤浸润免疫细胞中重要的基因靶点，我们下载了他们的数据并重新分析了细胞因子靶点的情况，惊奇的发现 IL-18 以及它的两个受体全部在肿瘤浸润 CD8 T 细胞中高表达，暗示了 IL-18 对于该类细胞的特异激活潜力。IL-18 作为 IL-1 家族的重要促炎因子，是 NLRP3 炎症小体下游的重要效应分子。它结合其异源二聚体受体 (IL-18Rα/Rβ) 介导了 MyD88-NFκΒ信号通路。IL-18 的主要功能之一是刺激 NK 细胞和抗原配对过的淋巴细胞产生γ干扰素。令人惊讶的是，具有如此免疫激活特性的细胞因子，十几年前它在肿瘤临床试验中却被发现没有效果，其二期临床试验以失败告终。如此巨大的反差，引起了我们对于 IL-18 的强烈兴趣。
生辉：您也提到 IL-18 功能很强大，那为什么临床试验会失败？
周挺：我们分析了他们发表的临床试验研究报告，发现很多指标中有一个叫做 IL-18BP 的蛋白在病人接受 IL-18 注射后，其浓度就会升高 10-100 倍，而且四个星期后仍然稳定存在。这么高的诱导表达是极为少见的。IL-18BP 是 IL-18 的诱饵受体 (decoy receptor)和天然抑制剂，它以超高亲和力 (1.1pM) 结合 IL-18 并阻止其与受体结合。我们通过生物信息学、免疫组化、ELISA 等多种手段确认了 IL-18BP 在人类肿瘤中高表达。同时我们也在小鼠肿瘤模型中做了试验，在肿瘤的建立过程中以及给小鼠注射 IL-18 后，IL-18BP 蛋白含量显著增高，验证了人体中的数据。后续我们使用 IL-18BP 敲除的老鼠进一步证实 IL-18BP 确实对 IL-18 的抗肿瘤效果有强烈的抑制作用。至此，我们确认 IL-18BP 作为一种可溶性的免疫检查点，而且是 IL-18 免疫治疗的主要障碍。
生辉：当你们发现 IL-18BP 有强烈抑制作用时，为什么不选择做抗体药物？
周挺：IL-18BP 蛋白结合 IL-18 的亲和力非常高。我们通过 SPR 测量了 IL-18BP 蛋白与 IL-18 的亲和力，大概是 1.1pM，这比以前文献里报道的 400nM 更加精确。而抗体和抗原的结合亲和力大多在 nM 级别，因此 IL-18:IL-18BP 的结合力比抗体: IL-18BP 结合力强三个数量级，因此用抗体来阻断是很难成功的。所以我们通过定向进化来改造 IL-18，让它不结合 IL-18BP，只结合它的受体。这样改造后的 IL-18 能刺激它的受体产生信号去激活免疫细胞，同时又能拮抗 IL-18BP 的功能。我们也将这个改造后的 “IL-18” 命名为 “DR-18”（Decoy-Resistant IL-18），“Decoy-Resistant” 意思就是“不结合抑制剂 IL-18BP”。
生辉：在将 IL-18 改造为 DR-18 的过程中，是否会担心改造不成功？
周挺：将 IL-18 改造成 “DR-18” 确实很有挑战。IL-18 和它的受体亲和力大概在 10nM，和 IL-18BP 的亲和力是 1.1pM，所以 IL-18 对于 IL-18BP 有一万倍的偏好性。能把这个偏好性去掉，同时还得保留受体的结合能力，单单通过人为点突变的方法是很难实现的，必须通过建立突变体库来进行筛选。我们首先通过结构生物学的分析，把 IL-18 与 IL-18BP 以及受体的共有的结合面找出来，大约有十几个位点。我们将每个位点突变成偏向受体结合的几种氨基酸，十几个位点便组合成了一个突变体库。我博士期间是研究蛋白质结构的，所以在蛋白质结构的分析和突变体库的设计上有一定的经验，经过导师的一些指点，我们做出了一个非常好的突变体库，这是成功的第一步。而最终的 “DR-18” 也确实是从这个具有 2.5 亿个突变体的库里成功筛选出来的。
成药的关键
生辉：您如何看待 DR-18 的安全性问题？
周挺：安全性肯定是药物研发中重点关注的问题，尤其是细胞因子的主要问题就是毒性太大。IL-18 本身就是一个免疫激活剂，改造后的 DR-18 是更强的激活剂，大家肯定担心其毒性。但是讨论毒性不能不结合剂量，再毒的东西给一点点其伤害可能不太大，毒性不大的东西给太多也会造成损伤。我们在小鼠中做过剂量爬坡实验，测试过不同的剂量、给药频率和日程，发现在有效治疗肿瘤的剂量窗口内（0.1～1mg/kg）基本没有明显毒性。我们分析了小鼠的肝脏、肺及消化道，几乎没有组织异常表现，血相上有些指标在给药时会有所降低但在停止给药后也都很快恢复正常。我们在猴子中也做了试验，观察到的结果是类似的。当然，这个药能不能够成功还得看临床的结果，肿瘤病人的免疫系统和身体其他机能跟正常人是有差别的，所以毒性问题还需要根据临床试验结果来确定。
生辉：DR-18 会和 PD-1 或者 CAR-T 进行联合治疗吗？
周挺：会的，这是一个很重要的方向。从原理上来说，细胞因子的作用机理和 PD-1 是有互补性的，它们介导的信号通路、引起的免疫反应、激活的细胞类型都不同，所以我们会尝试组合，进行联合治疗。细胞因子作为效应分子装进 CAR-T 里是很常见的设计，目前我们正在和宾州大学两个团队进行相关合作。当然我们主要还是会尝试单药，从实验数据看单药效果是很好的。
生辉：您认为这次对细胞因子疗法的研究突破是什么？
周挺：突破主要是对靶点的选择和改造。因为细胞因子治疗虽然从 80 年代就开始，但从一型干扰素和 IL-2 之后，FDA 就再也没有批准新药。目前研究细胞因子治疗主要是两大类：一类是，把已经批准的两款药与其他放疗化疗药联用；另一类是新修饰和融合蛋白药，围绕 IL-2、IL-10 和 IL-15 三个靶点，譬如 Nektar 公司的聚乙二醇交联 IL-2 (NKTR-214)、礼来公司 (收购 ARMO) 的聚乙二醇交联 IL-10 (Pegilodecakin)，以及 Altor 的 IL-15/IL-15Rα/IgG1 Fc 融合蛋白(ALT-803)，但临床结果有好有坏，还需要更长的时间观察。IL-18 可以说是一个全新的靶点。虽然十年前 GSK 围绕它做临床试验，但是失败了，之后就没有人再继续研究。我们这次明确了 IL-18BP 作为 IL-18 治疗的障碍，并通过生物学功能的改造重塑了它的应用前景。
生辉：DR-18 会有半衰期短的问题吗？
周挺：作为小的细胞因子蛋白，半衰期是短，但这不是问题。DR-18 的半衰期只有两个多小时，但这已经激起了足够多的免疫效应。我们曾经尝试过 DR-18 和 Fc、HSA 等融合设计，但增加了半衰期并没有增加药效，所以我们最终决定放弃。我们还对比过静脉给药和皮下注射等不同给药手段，皮下虽然其 Cmax（the peak serum level，血清最高水平）比较低，但是具有更大的 AUC（the Area Under the serum concentration time Curve，血清浓度时间曲线下的面积）。另外，我们认为在试验中没有观察到明显的 DR-18 的毒性，可能也与半衰期短有关，所以我们决定最终药物制剂就用 DR-18 蛋白。
生辉：DR-18 会是一次性给药，还是像干扰素一样需要长期给药？
周挺：DR-18 和干扰素是不同的。干扰素长期给药的原因是毒性较大，不能一次性给足剂量，只能分批给药。而在我们临床前试验结果显示，在小鼠身上一周只需打两次 DR-18（0.32mg/kg），就足够让 60%-80% 的肿瘤消失。在猴子身上一周也只需要打两次，甚至有些情况下一周打一次，就已经观察到足够的药效。所以 DR-18 理论上来说不需要多次给药，当然具体的临床实验给药剂量、日程、频率等问题还得靠有经验的临床人员去决定。
寻找，有趣的事儿
生辉：可以简单介绍一下您的科研经历吗？
周挺：我这个人一直都不太满足于自己的现状，一直想挑战自己，所以到目前为止整个科研训练都是一个内心上追寻的历程，寻找一个自己擅长做的，喜欢做的，且有意义的交汇点。我在中国农业大学读本科时，我研究的是作物遗传学方向。接着去中科院生物物理所读研时，比较着迷于蛋白质结构。这也是我科研训练里面最长的一段经历，那时常苦恼于自己在蛋白质方面积累的经验在以后没有用武之地，没想到冥冥之中却成了我第二站博后以及整个科研生涯的一个主推力。2014 年博士毕业来到耶鲁大学分子细胞发育生物学系做第一站博后，本想从蛋白质换换口味到研究核酸（RNA）的结构与功能，但事与愿违。草草两年结束之后，在王俊师兄牵线下，2016 年加入了耶鲁免疫系我现在的导师实验室，研究细胞因子在肿瘤免疫上的功能。在这里，我以前的训练背景、自己的兴趣爱好和重要的科学问题等都很好地结合在了一起。
生辉：第二站博后经历里哪些因素比较重要？
周挺：我可以从三个方面说一下，大环境、微环境和人。大环境是耶鲁免疫系的大环境。作为全美排名第一的免疫系，虽有那些如雷贯耳的 big name，但我认为最重要的是整个系自建系以来历经各代宗师所养成的精神气质，一种纯粹和极致的追求重要科学问题的面貌，一种毫无保留无私分享和交流合作的氛围，一种尊重每个个体和全方位培养 trainee 的态度（个别除外）。微环境就是我所在的实验室，导师年轻有活力，组里其他研究生都是绝顶聪明，博后都是高效高产。影响我的人太多，把我 “拐” 进免疫系的王俊师兄（现为纽约大学助理教授）“首当其冲”，从来没摸过老鼠的我起步就是他教的，后续他在我课题上的帮助、对于很多科学问题的见解以及他对研究的专注程度，对我影响颇深。我身边还有一群经常深入讨论的大牛博后朋友们，譬如先天免疫专家周旭博士（现为哈佛大学助理教授），心血管研究专家陶波博士，细胞生物学专家邓永强博士（现为南方医科大学教授），超分辨硬件专家章永登博士（现为西湖大学助理教授），Rag2 专家张宇航博士等，每次与他们的深入讨论都让我受益匪浅。还有不得不提的是免疫系和其他系聪明绝顶的研究生朋友们，这些高浓度存在的“非人类”，经常让我陷入“绝望”，但也时刻激励着我前进。
生辉：您是否有回国计划？
周挺：我目前打算回国建立实验室，继续以细胞因子为切入点，去研究免疫过度抑制（肿瘤）和过度激活（炎症疾病）的机制。我觉得细胞因子是抗肿瘤的重要一环，细胞因子激动剂是一个很好的方向，只是沉寂的太久了。之所以沉寂，是因为 “多能性” 等问题一直很难解决，而定向进化和酵母展示技术，就是天生解决这个问题的利器。在肿瘤、自身免疫病和炎症疾病的治疗上，我认为细胞因子“大有可为”！
