编者按：
在我们的肠道内生存着数十万亿的微生物，它们可以通过产生小分子物质对环境作出反应。这些分子中的一些会影响人类宿主或邻近的微生物。目前，已有不少研究揭示了菌群在生理和疾病中的作用，但其中涉及的菌群分子和相关机制仍有很多未知。
2019 年 12 月 13 日的 Science 杂志上，来自哈佛医学院的马修·享克（M. T. Henke）博士和乔恩·克拉迪（J. Clardy） 教授介绍了两种方法来鉴定细菌产生的分子及相关功能。今天我们以此文为基础，总结整理了近期与菌群小分子产物相关的一些报道。
① 从基因组到菌群产物：技术之困
测序技术的发展让科学家们从肠道菌群中获得越来越多的 DNA 序列数据。2019 年初，华大基因的肖亮、贾慧珏和李俊桦团队在 Nature Biotechnology 上发布了健康人粪便样本中获得的 1520 个单菌基因组草图。
Nature Medicine 2019 年 9 月发表的一项研究中，介绍了一个大型的人肠道菌群资源库 BIO-ML，该资源库包含了近 8000 个肠道菌分离株和 3600 多个菌株的基因组序列。
华大基因团队：1520个人肠道单细菌参考基因组，助力菌群研究
Nature Biotechnology——[IF:31.864]
① 用培养组学分离>6000 个人粪便菌株，得到 1520 个高质量单菌基因组草图（338 个种），构成可培养基因组参考（CGR）数据集；② 包括人肠道的主要细菌门和属，含至少 264 个新参考基因组，有不少低丰度菌，丰富了现有参考基因组，提高了宏基因组学分析的分辨率（读段比对率和 SNP 分析等）；③ 对CGR 的功能注释加深了对肠道菌功能的认知；④ 对 38 种重要菌的泛基因组分析，揭示不同菌门的泛基因组开合趋势和在各自核心和非核心基因组上功能富集的差异。
1,520 reference genomes from cultivated human gut bacteria enable functional microbiome analyses
02-04, doi: 10.1038/s41587-018-0008-8
【主编评语】华大基因的肖亮、贾慧珏和李俊桦与团队的重要研究，近期在 Nature Biotechnology 发表。该研究通过培养组学方法，从健康人粪便样本中获得 1520 个单菌基因组草图，对现有的人肠道细菌参考基因组有很大补充；并通过功能注释和泛基因组分析，加深了对肠道细菌功能和特点的了解。这些成果将助力人肠道宏基因组学分析和相关应用转化研究，值得专业人士仔细阅读。（@mildbreeze）
Nature子刊：人体肠道菌群研究再添重要资源
Nature Medicine——[IF:30.641]
① BIO-ML 是一个人肠道细菌生物库，可用于研究肠道菌群的动态变化和机制；② 包含 7758 个人肠道细菌分离株，3632 个菌株有全基因组序列，覆盖大部分人肠道菌多样性；③ 还包括>80 名个体的 16S、宏基因组和代谢组的多个时间点纵向数据；④ 使用多天样本的平均值可提高组学方法数据的可靠性；⑤ 肠道菌群代谢物在个体内随时间的变化与氨基酸相关，粪便代谢组的个体间差异与胆汁酸谱相关；⑥ 个体内的细菌基因组变化可用于推断生态进化动态和选择压力。
A library of human gut bacterial isolates paired with longitudinal multiomics data enables mechanistic microbiome research
09-02, doi: 10.1038/s41591-019-0559-3
【主编评语】肠道菌群研究的下个阶段，将在菌株水平分析肠道菌对宿主健康的作用机制。Nature Medicine 发表的最新研究，介绍了一个大型的人肠道菌群资源库 BIO-ML，不仅包含近 8000 个肠道菌分离株和 3600 多个菌株的基因组序列，还包括 80 多人的多组学纵向数据，为研究肠道菌群动态和机制再添有力资源。（@mildbreeze）
大量的基因组数据揭示了肠道菌群的生物合成潜力。从这个意义上讲，人类微生物组研究大致处于 2003 年的人类基因组计划所达到的阶段，已经可以很好地掌握所涉及的基因。
但是如何通过这些数据弄清楚哪些细菌在发出什么分子信息，这些信息又发送给了谁是一项非常复杂、艰巨的任务。
来自哈佛医学院的马修·享克（M. T. Henke） 博士和乔恩·克拉迪（J. Clardy）在 Science 杂志上发表的文章介绍了近期的两项科研成果：两个团队通过不同的方法迎接了这个挑战。
来自普林斯顿大学 Mohamed S. Donia 团队开发了一项名为 MetaBGC 的新算法，该算法能够鉴定人类微生物组中的小分子生物合成基因（BGC）。
通过对 2544 个人类宏基因组样本进行分析，发现约半数个体的菌群中都存在II型聚酮化合物合酶的基因合成簇。同时，该团队还用合成生物学策略对新发现的产物进行表达纯化，发现这类分子具有抗菌活性。
Science：从人类微生物组的数据海洋中，揪出菌群的生物活性小分子
Science—— [IF:41.037]
① 开发一种计算机算法 MetaBGC，可基于宏基因组测序的读段数据，鉴定人类微生物组中的小分子生物合成基因簇（BGC）；② 用 MetaBGC 分析 2544 个人类宏基因组样本，发现约半数个体的菌群中都存在 II 型聚酮合酶（TII-PKS）的 BGC，其中 13 个为新发现的，被多样化的菌群成员编码和表达；③ 用合成生物学策略对新发现的 TII-PKS BGC 产物进行表达和纯化，明确了分子结构，并发现这类分子具有抗菌活性，可能在生态位竞争和宿主防御中发挥作用。
A metagenomic strategy for harnessing the chemical repertoire of the human microbiome
10-04, doi: 10.1126/science.aax9176
【主编评语】已有不少研究揭示了菌群在生理和疾病中的作用，但其中涉及的菌群分子和相关机制仍有很多未知。Science 刚刚发表了由普林斯顿大学 Mohamed S. Donia 团队主导的最新研究，报道了一种新的算法 MetaBGC，与合成生物学方法结合使用，可从人类宏基因组数据中鉴定具有生物活性作用的菌群小分子。该研究中以II型聚酮合酶（TII-PKS）的生物合成基因簇（BGC）为例进行分析（这是一类不常见的细菌 BGC，但其已知的小分子产物中包括四环素和抗癌药阿霉素，具有临床药用价值），表明 TII-PKS BGC 广泛存在于人类微生物组成员中。这种微生物组分析方法，为系统性研究介导菌群-宿主以及菌群-菌群互作的生物活性分子，提供了有力手段。（@mildbreeze）
另一个来自斯坦福大学的 Michael A. Fischbach 团队日前（2019 年 12 月）在 Science 杂志上发表论文，介绍了一种基于 CRISPR-Cas9 系统的方法，实现了对肠道共生梭菌的多基因敲除。并通过小鼠定植实验，发现生孢梭菌产生的支链短链脂肪酸对宿主具有免疫调控功能。
Science：研究肠道菌产物对宿主影响的新利器
Science——[IF:41.037]
① 开发一种基于 CRISPR-Cas9 的方法，可实现对肠道共生梭菌的多基因敲除；② 以生孢梭菌（Cs）为模式菌，成功敲除了 10 个 Cs 衍生分子（三甲胺、多种短链脂肪酸（SCFA）和支链 SCFA 等）合成通路中的基因；③ 并用质谱方法和无菌小鼠定植试验证实，得到的突变株无法产生相应的分子产物；④ 对比定植野生型 Cs 菌株和无法产生 3 种支链 SCFA（异丁酸、2-甲基丁酸、异戊酸）的双基因敲除 Cs 突变株的小鼠，发现这些分子可调控宿主产生IgA 的浆细胞。
Depletion of microbiome-derived molecules in the host using Clostridium genetics
12-13, doi: 10.1126/science.aav1282
【主编评语】肠道菌群可产生大量多样化的生物活性分子，对宿主的生理活动和健康产生影响。然而由于缺乏相应的遗传操纵工具，人们一直难以深入分析特定细菌产物对宿主的影响和作用机制。比如哺乳动物肠道中常见的共生梭菌，就是一类难以进行遗传操纵的细菌。Science 最新上线的一项研究报道了一种可对梭菌进行多基因敲除的方法，并通过小鼠定植实验，发现生孢梭菌产生的支链短链脂肪酸对宿主的免疫调控功能。这种方法不仅可研究梭菌等细菌产生的分子对宿主的影响，也可通过编辑特定细菌的基因组，实现对特定菌群产物的调控。（@mildbreeze）
上述工具和方法的出现对揭示次级代谢产物合成在致病过程中的作用机制具有重要意义，为从基因组信息挖掘到下游分子机制验证提供了可能。事实上，虽然有一些小组已经开发了一些能够适用于部分菌群的遗传工具，但是目前对于人类肠道菌群而言，缺乏一套广泛适用的遗传工具。
可是，敲除基因、回补基因等等遗传操作对机理研究十分重要。尽管为每个感兴趣的菌株开发一套工具似乎既繁琐又令人生畏，但这可能是最好的方法，因为开发广泛应用的遗传工具十分困难。
② 菌群产物：未开发的宝库
土壤微生物的产物一直是临床上使用的小分子药物的宝贵来源，而人类微生物或许是下一个宝库。
一些研究发现肠道和口腔微生物产生的分子与临床使用的药物类似，主要是II型聚酮化合物。聚酮化合物是一类由细菌、真菌、植物与动物所产生出来的二级代谢产物，这类物质对生物的发育生长而言非必要，但可用于防卫或细胞间的沟通。
该类化合物中包括许多具有抑制细菌（如红霉素、四环素）、真菌（如灰黄霉素、两性霉素）、寄生虫（如 Avermectin、奈马克丁）、癌症（如多柔比星）等活性的化合物，被广泛应用于医药、畜牧和农业。
过去我们往往使用“抑菌圈”的筛选方法筛选抗生素。可是，传统的抗生素方法似乎早已进入了瓶颈，在最近的几十年，一直鲜有收获。即便是现在最厉害的头孢霉素，其实也不过是青霉素的“孪生兄弟”而已。
头孢霉素在结构上与青霉素有许多相似之处，均由类似的母核与侧链组成。不同之处在于侧链结构有差别，青霉素母核的五元环在头孢霉素母核上为六元环。
而生物信息技术和其他相关技术的发展或许可以帮助我们开拓新的筛选方法，从微生物的产物中筛选获得新药物的候选者。我们可以通过根据与已知的保守结构域的同源性来寻找新的分子。
当然，有时候具有相似结构的分子可能不具有相似的功能，所以我们可以尝试筛选分子类似物，这样或许会带来一些新的惊喜。另一方法是更改算法拒绝含有目标基因与已知途径相似的通路。
③ Colibactin：肠道菌群致癌物
显然，并非所有的菌群产物都是有益的。近年来越来越多的研究发现菌群的一些产物正是致病的关键。比如一种名为 Colibactin 的细菌产物。
研究发现，特定肠道菌可促进结直肠癌（CRC）的发生。在 2018 年初， Science 杂志曾发表研究：在家族性息肉病患者中鉴定出了两种潜在的促结直肠癌细菌。而其中一株聚酮化合物合酶阳性（pks+）大肠杆菌就可以产生 Colibactin。而 Colibactin 可能正是结直肠癌的罪魁祸首。
2019 年 3 月，哈佛医学院的 Emily P. Balskus 小组在 Science 杂志上发表文章解析了 Colibactin 可能的致癌机理。该研究发现，Colibactin 的环丙烷环结构能像“弹头”一样“扎入” DNA 链，与腺嘌呤发生烷基化反应形成 DNA 加合物，从而损伤 DNA 结构。
Science：大肠癌相关细菌毒素怎样损伤DNA？
Science—— [IF:41.037]
① 含有生物合成基因岛 pks 的大肠杆菌可产生细菌毒素 colibactin，可能促进大肠癌发生；② 用非靶向 DNA 加合物组学，在与 pks+ 大肠杆菌共培养的上皮细胞系中，鉴定出 2 种特异性富集的 DNA 腺嘌呤烷基化加合物，推测是不稳定的 colibactin-DNA 交联结构的分解衍生物；③ 给无菌小鼠定植 pks+ 大肠杆菌，在结肠上皮细胞中也检测出上述 DNA 加合物；④ 通过化学合成等方法解析了 DNA 加合物的化学结构，colibactin 的环丙烷环在其与 DNA 的烷基化反应中有关键作用。
The human gut bacterial genotoxin colibactin alkylates DNA
02-15, doi: 10.1126/science.aar7785
【主编评语】特定肠道菌可促进结直肠癌（CRC）的发生，一年前 Science 曾发表研究，在家族性息肉病患者中鉴定出两种潜在的促 CRC 肠道菌，其中就包括能产生基因毒素 colibactin 的 pks+ 大肠杆菌。然而研究者对 colibactin 进行纯化分离的尝试均告失败，阻碍了对其损伤 DNA 的机制的解析。Science 今天上线的一项最新研究发现，colibactin 的环丙烷环结构能像“弹头”一样“扎入” DNA 链，与腺嘌呤发生烷基化反应形成 DNA 加合物，从而损伤 DNA 结构，是促进大肠癌的潜在分子机制。这种 DNA 加合物或许能作为 pks+ 大肠杆菌暴露的生物标志物，用于预测 CRC 风险，其临床转化价值有待进一步研究。（@mildbreeze）
2019 年 9 月，耶鲁大学的 Jason M. Crawford 团队运用遗传学、同位素标记、串联质谱、化学合成等多种跨学科手段，最终推导出了 Colibactin 的结构， 发现 Colibactin 是由两个复杂的生物合成中间体结合而成，可以攻击 DNA 引起损伤。
Science：首次colibactin结构解析
Science——[IF:41.037]
① 采用跨学科组合的方式推导出 Colibactin 是由两个复杂的生物合成中间体结合而成；② 具有包含两个亲电环丙烷弹头的几乎对称的结构，其每一个残基均通过核苷酸的添加而开环；③ 利用基因组编辑技术证明，Colibactin 前体（precolibactin 1489）的产生需要 Colibactin 基因簇中的每一个生物合成基因，意味着其生物合成途径十分复杂；④ 化学合成 Colibactin 的方法为研究人员深入探索代谢物和炎症相关结肠癌之间的因果关系提供可能。
Structure elucidation of colibactin and its DNA cross-links
09-06, doi: 10.1126/science.aax2685
【主编评语】Colibactin 是由某些具有基因毒性大肠杆菌产生的一种复杂的次生代谢产物，生产 Colibactin 的细菌的存在与人类结直肠癌的发生频率和严重程度有关。但由于 Colibactin 从未被分离和结构解析，因此研究 Colibactin 在人体肠道中的生理作用一直是一个难题。近日发表在 Science 上的研究第一次运用遗传学、同位素标记、串联质谱、化学合成等多种跨学科手段推导出 Colibactin 的结构，解释了所有已知的生物合成和细胞生物学数据，并提出了在大肠杆菌肌动蛋白基因簇中最终尚未清楚解释过的酶的作用。（@楂小夭）
④ 结语
人类微生物组学研究面临着解析菌群及其相关分子与人类健康、疾病间互作机制的挑战，通过本文所介绍的这些研究结果，相信大家都已经意识到微生物群研究的新突破将越来越依赖于遗传学家、微生物学家、化学家、免疫学家和医生之间的合作。
相信未来我们会有越来越多的方法和手段探究菌群产物的详细机制，也相信我们会从人体微生物这个“黑箱”中挖掘到越来越多的有效信息。
参考资料：https://www.im.cas.cn/kxcb/shzdwsw/201010/t20101009_2983820.html
作者 | 高春辉博士（热心肠研究院数据科学家）
审校 | 617
