怎样才能让mRNA疫苗在体内稳定表达?

mRNA 疫苗从体外注射到体内,会引起一系列免疫反应,就像是身体在对抗病毒入侵一般。对此 Moderna 和 BioNTech 利用假尿嘧啶修饰 mRNA 解决上述问题,以保证其在体内稳定表达。

生辉之前分析了 mRNA 疫苗的关键技术。(关注生辉[ID:sciphi]微信公众号查看《mRNA疫苗的三道必答难题:递送、给药、专利》)mRNA 成药还得解答一道附加题——能让其体内稳定表达的修饰过程。

“修饰”的必要性

生产 mRNA 疫苗过程中的酶促反应会生成一些双链 RNA,产生应激反应,最终导致翻译抑制和 mRNA 降解。对制备的 mRNA 进行纯化,减少双链副产物,减少免疫反应。单链 RNA 本身也是一种 PAMP,能够引起 I 型干扰素产生。

目前已有多种修饰技术被用于产生更稳定的 mRNA。1)用人工合成的非天然核糖核酸替换天然核糖核酸来合成 mRNA;2)加上 5’帽子、3’ poly(A)“尾巴“和 UTR (untranslated region)序列;3)利用特殊的新型制剂技术,有效地保护 mRNA。

图丨 mRNA 修饰途径方法(来源:Cell)

具体作用效果如下:

1)合成 “帽子” 类似结构和“加帽酶(capping enzymes)” 来稳定 mRNA,通过与真核翻译起始因子 4E(eukaryotic translation initiation factor 4,EIF4E)的结合来增强蛋白质的翻译;

2)在 5’和 3’UTR 区域增加可调控序列,稳定 mRNA;

3)修饰 Poly(A)“尾巴”,稳定 mRNA,增强蛋白质翻译;

4)修饰核苷酸,减少先天免疫激活;

5)分离和(或)纯化技术:利用 RNase III 处理和快速蛋白液相色谱(fast protein liquid chromatography,FPLC)纯化,降低免疫激活并提高翻译率;

6)优化序列和密码子,选择与 tRNA 同源的密码子,提高翻译率;

7)靶细胞的调节:翻译起始因子和其他方法的共同递送,优化翻译和免疫原性。

大厂利器:假尿嘧啶修饰

化学修饰是调节生物大分子功能特异性的方法,并涉及多种疾病的治疗(包括癌症等)。现有研究表明,在 RNA 中已显示存在着 150 多种不同类型的合成后修饰,RNA 的 4 种碱基以及核糖都可以成为修饰的靶标。换句话说,此种方式用人工合成的非天然核糖核酸替换天然核糖核酸来合成 mRNA,从而大大降低其固有的免疫原性和不稳定性。

其中,在真核生物 mRNA 上发现的修饰总共有 16 种,其中有 13 种修饰已被 RNA 修饰数据库(RNA Modification Database, RNAMDB)收录,这些修饰可以分为甲基化、假尿嘧啶化和次黄嘌呤三类。对哺乳动物内部的 mRNA 修饰主要围绕 N1 - 和 N6 - 甲基腺苷(m1A,m6A),3 - 和 5 - 甲基胞嘧啶(m3C,m5C),5 - 羟甲基胞嘧啶(hm5C),假尿苷 (Ψ) 和 2'-O - 甲基化(Nm)等。

在 mRNA 疫苗研发过程中,主要的修饰方法是 N6 - 甲基腺苷、假尿苷 (Ψ) 和 2'-O - 甲基化(Nm)。N6 - 甲基腺苷(m6A)起到调节 mRNA 稳定性的作用。而人体对 mRNA 疫苗的免疫反应主要和尿苷 (部分由尿嘧啶组成)有关,利用假尿嘧啶替代尿嘧啶就能够减少免疫系统对 mRNA 的识别,RNA 5' 帽子的 2'-O- 甲基化修饰可以使其逃脱宿主的抗病毒应答。

mRNA 疫苗“大厂”Moderna 和 BioNTech 都是利用假尿嘧啶修饰保持 mRNA 的稳定性。

假尿嘧啶修饰是最丰富的 RNA 修饰,一般由尿苷的异构化产生,已有的研究表明,mRNA 的假尿嘧啶化修饰主要有三个功能:改变密码子、增强转录本稳定性和应激反应应答。mRNA 假尿嘧啶化修饰的过程是由假尿嘧啶合成酶(pseudouridine synthases,PUS)进行催化,让尿嘧啶核苷酸(U)化学结构发生改变,形成假尿嘧啶核苷核苷酸。之前研究已在 tRNA、rRNA、snRNA 中发现了大量的假尿嘧啶,最近的研究证实假尿嘧啶同样存在于 mRNA 中。

2011 年,Karijolich 等发现,mRNA 上的假尿嘧啶化修饰可以改变密码子。将酵母中的密码子中的尿嘧啶 (U) 替换为假尿嘧啶,这些密码子就能编码氨基酸,2014 年,Schwartz 等发现,酵母发生热休克时,会由 Pus7p(一种蛋白) 额外引入超过 200 个假尿嘧啶修饰位点,如果敲除 PUS7 基因,则那些含有新引入修饰的 mRNA 会减少,这说明着假尿嘧啶修饰可能会增强转录本稳定性。

Moderna 在成立之初,其创始人之一 Derrick Rossi 将 RNA 中的尿嘧啶、胞嘧啶替换为假尿嘧啶、5 - 甲基胞嘧啶,修饰后的 RNA 更像是细胞内源性物质,从而克服天然免疫应答(现已经发展到第六代)。这种 RNA 修饰方法并不是 Rossi 首创,发明人是宾夕法尼亚大学的 Katalin Karikó 和 Drew Weissman,关于这项修饰技术归属权问题,也一直是 Moderna 的受争议的原因之一。

图丨 Moderna 官方并没有给出太多技术平台的细节(图片来源:Moderna 官网)

2017 年 9 月,BioNTech 获得 CELLSCRIPT 公司的核苷修饰 RNA 技术的使用许可,修饰的的方式也是假尿嘧啶修饰,目前 CELLSCRIPT 公司的修饰产品已经在多个国家售卖,应用广泛。