“以具备治愈数千种遗传性疾病潜力而闻名的‘革命性技术’CRISPR，也可以解决 Covid-19 诊断测试所面临的挑战。”
5 月 5 日，Broad 研究所的著名学者张锋教授和他在 Broad 研究所、麻省理工学院（MIT）麦戈文脑科学研究所（McGovern Institute for Brain Research）的合作伙伴一起，公布了他们开发的新一代新冠病毒 CRISPR 检测技术的实验流程。
（来源：McGovern Institute for Brain Research）
该检测过程中不需要从患者样本中纯化 RNA，并且将检测新冠病毒所需的化学反应步骤在一个试管中完成。在检验 12 个新冠病毒阳性和 5 个新冠病毒阴性样本的实验中，这一检测达到 100% 的特异性和 97% 的灵敏度。
更高效：无需纯化病毒 RNA，检测过程仅在一个试管内完成
由新型冠状病毒 SARS-CoV-2 导致的 COVD-19 可以使用 RT-qPCR（实时荧光定量 PRC）进行诊断，在 RT-qPCR 实验中，RNA 提取完成后需要对 RNA 的质量进行评估，合格后才可进行后续实验，虽然操作流程简单，经济高效，需要的 RNA 加样量少，但也存在易污染的问题，极其微量的污染即可导致假阳性。新冠疫情爆发期间，RT-qPCR 检测试剂和设备的不足大大减慢了疾病检测的进度。
今年 2 月张锋团队曾发表论文，基于等温扩增和 CRISPR 介导检测相结合的替代方法（SHERLOCK：Specific High Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing），对新冠病毒进行检测。
SHERLOCK 技术的核心是一种叫做 Cas13a 的蛋白酶和与其结合的向导 RNA。根据新冠病毒的 RNA 序列，研究人员设计了能够靶向新冠病毒特异性序列的向导 RNA，只要样本里有新冠病毒所对应的 RNA，向导 RNA 就能对其进行精准的识别，并激活与其结合的 Cas13a 蛋白酶，被激活的 Cas13a 蛋白酶可以切开所遇到的任何 RNA 分子。同时，研究人员们在样本里还会添加一种通过 RNA 相连接的特殊分子，伴随着 Cas13a 的激活，这种特殊分子上的 RNA 就会被切断，通过确认这些分子是否被切断，就能知道最初的样本里有没有新冠病毒的存在。
该技术减少了对 RT-qPCR 设备的依赖，但先前报道的方法仍需要多个前处理步骤，而且样本通常要运送到中央实验室中进行检测，可能延误对患者的诊断和治疗时间，更多的样本转移步骤可能带来的污染使其检测部署更加复杂。
因此，研发团队本次开发一种更为简便的检测手段，让扩增 RNA 数目的等温扩增步骤和 Cas 酶检测的化学反应能够在同一个试管中进行。为此，他们选择了环介导等温扩增技术（Loop-mediated Isothermal Amplification, LAMP）作为扩增 RNA 的方法，LAMP 所需的试剂并不难于获取，具备较高的实用性。
LAMP 反应需要在温度为 60℃的反应条件下进行，而 Cas13a 在这一温度下不够稳定。针对这一问题，研究人员找到了名为 AapCas12b 的 Cas 酶，能够在 LAMP 反应条件下维持足够的活性，同时对指导 RNA 和反应中的添加剂进行了优化，让 Cas 酶介导的检测步骤维持足够的灵敏度。在实验条件下，这一检测的下限为 100 个新冠病毒 RNA 分子。
图丨 STOPCovid 检测的测试流程（来源：上述论文)
张锋团队将其命名为“STOP”（SHERLOCK Testing in One Pot），可在一小时内检测 SARS-CoV-2，该测试（STOPCovid）具备与 RT-qPCR 水平相当的灵敏度，同时简化了提取 RNA 的步骤，只需要在含有新冠病毒的咽拭子或唾液样本中加入裂解病毒、释放 RNA 的试剂，无需纯化分离 RNA，就可以将释放的病毒 RNA 用于检测，整个过程仅在一个试管内即可完成。
“STOPCovid 甚至可能在家里或工作场所使用，与怀孕检测试纸无异，它的价格便宜，不需要特定的实验室，并且可以在一小时内得到结果。可广泛应用、准确、价格低廉等特点将有助于解决现在对 COVD-19 检测的迫切需求。”张锋对海外媒体 STAT 表示。
更准确：STOPCovid 在检测患者样本时表现出 100% 特异性
目前，新冠肺炎的实验室检测主要从两方面进行：一是病原学检测，即新冠病毒核酸检测；另一个是血清学检测，即新冠病毒特异性 IgM 抗体检测。
通常所说的唾液采样和鼻咽拭子采样都是基于 RT-qPCR 进行新冠病毒核酸检测。唾液检测的优点在于采样方便，能减少医务人员的感染风险，提高患者接受度。唾液中的病毒含量会随着疾病的发展而发生变化，与鼻咽拭子相同，唾液检测的质量也受样本采集因素影响。
除张锋团队外，已许多研究团队从唾液 / 鼻咽或口咽拭子中提取 RNA，体外扩增后用 CRISPR 检测预定义的冠状病毒序列，以此替代唾液 / 鼻咽或口咽拭子 RT-qPCR 检测，其技术原理与 SHERLOCK 技术并无本质差异，也存在相似的污染导致的假阳性问题。
例如，就在上个月，加利福尼亚大学旧金山分校和 Mammoth Biosciences 的科学家公布了 CRISPR 工具，其检测时间大约需要 40 分钟，远快于 RT-qPCR。但这些技术虽具备速度快的优势，但其假阳性较 RT-qPCR 检测更高。
产生此现象最主要的原因是 CRISPR 检测新冠病毒需要两个步骤：1）使用等温扩增（isothermal amplification）反应扩增 RNA 的数量；2）将扩增的样本加入到包含 Cas 酶和其它反应试剂的试管中进行检测反应。这不但增加了检测流程的复杂性，而且更多的样本转移步骤让交叉污染的可能性增大。
此次发布的 “STOPCovid” 的关键进展是将上述 “两步走” 过程简化为一步反应，进而防治了样本转移过程中的交叉污染，让检测结果更准确。“这使 STOPCovid 适合在新冠病毒快速检测站即时使用。”张锋说。
本次试验，研究人员使用 12 个新冠病毒阳性和 5 个新冠病毒阴性患者咽拭子样本对 STOPCovid 检测的特异性和灵敏度进行了检验。每个样本都进行了三重测试（triplicate）。实验结果表明，在 5 个新冠病毒阴性的样本中，STOPCovid 没有给出任何假阳性结果，而在 12 个新冠病毒阳性样本中，STOPCovid 在 11 个样本的三次测试中都给出阳性结果，在 1 个样本的三次测试中两次给出阳性结果。
图丨STOPCovid 检测结果（来源：上述论文）
目前，研究团队已经与美国 FDA 进行交流，探索获得紧急使用授权（EUA）所需要的步骤。同时，科学家们已经准备了可进行 10000 次测试的工具，以便供想要评估其潜在诊断用途的研究人员自由使用。
