编者按：
打着骨头连着筋，哦，不对，“打着微生物”连着骨头？
近年来，有研究人员提出了一个跨学科的新研究领域——骨微生物学，以探究骨头与微生物之间存在的关联。而研究也已经表明肠道微生物在骨质疏松的过程中会发挥一定的作用。
之前《热心肠日报》也对骨微生物学这一概念进行过报道：
BONE：肠道菌群对骨骼的影响（综述）
Bone——[4.36]
① Ohlsson等人提出了“骨微生物学”这一概念，表示菌群通过调节出生后的骨骼发育、骨骼老化、病理性骨质流失，从而影响宿主的健康及疾病状态；② 本综述讨论了“骨微生物学”这一领域的建立，介绍了“骨微生物学”的研究方法；③ 并介绍了菌群对骨质量的影响，以及肠道上皮通透性是如何影响骨转换（turnover）速率的；④ 最后展望了将益生菌用于增强骨骼形成的治疗手段。
Osteomicrobiology: The influence of gut microbiota on bone in health and disease
2017-04-19,doi:10.1016/j.bone.2017.04.009
【主编评语】肠道菌群会对骨骼的功能产生影响，这篇综述特别关注于此，值得认真读一读。（@szx）
在未来，我们或许可以通过肠道菌群预测骨质疏松和骨折的风险。此外，肠道菌群也有可能会成为骨质疏松的治疗新靶点，为人们治疗骨质疏松提供全新的解决方案。
今天我们就来聊聊骨骼和微生物之间的微妙关系，希望本文能给相关的产业人士和研究人员带来一些灵感。
① 骨骼与肠道微生物
肠道菌群是生活在我们肠道内的所有微生物的整体，它们与宿主免疫系统之间存在着复杂的相互作用。
已有文献报道，肠道菌群可以通过产生短链脂肪酸、吲哚衍生物、多胺和次生胆汁酸等分子与非肠内细胞如免疫细胞、树突状细胞和肝细胞发生相互作用，从而进一步对身体某些部位产生影响。
这也是微生物组失调与多种疾病（如自身免疫病、代谢和神经退行性疾病等）相关的原因。
（关于自身免疫，推荐阅读：治疗自身免疫性疾病，或可从肠道菌群入手！）
然而，我们的免疫细胞和骨细胞之间也存有密切相互作用，因此肠道菌群的改变可能还会影响骨骼健康。
② LauraMcCabe碰撞的火花
十多年来，Laura McCabe一直在密歇根州立大学（Michigan State University）扮演着双重职业的角色，她一边在实验室研究骨骼，一边在教室里给医学生讲授肠胃生理学。
某一天，她突然接到克罗恩病和结肠炎基金会（ the Crohn’s and Colitis Foundation）的邀请，该基金会希望 McCabe 能够参与到“炎症性肠病是如何影响骨骼的?”这个问题答案的寻找过程中。
McCabe 说：“我想，‘这个问题和我从事的研究相契合，是一个可以让我实现自我价值的课题!’”。于是，2007 年，McCabe 获得了资助，开始了该课题的研究。从此，她的两个本来毫无关联的学科碰撞出了新火花。
研究人员已经观察到患有炎症性肠炎的病人出现了骨质流失的现象，可问题来了：究竟是什么原因呢？
McCabe 在小鼠实验中发现，如果小鼠肠道出现细菌感染或用一种洗涤剂破坏小鼠的肠道上皮屏障，会引起小鼠的骨质流失。
McCabe 说：“显然，我们对肠道做的这些伤害（比如肠道发炎等）会导致骨质流失，所以，我们会自然地想到：我们做什么会对骨骼有益呢？”
③ 罗伊氏乳杆菌对骨骼有益？
她与密歇根州立大学的同事 Rob Britton 进行了讨论，Britton 建议 McCabe 尝试一种他在微生物实验室里研究过的益生菌——罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）。Britton 认为该菌能促进肠道健康，因此，或许它能改善骨骼问题。
于是，两位研究人员们在健康的雄性老鼠身上进行了试验。
McCabe 说：“当结果出来时，我们真的大吃一惊。这种细菌不仅减少了肠道炎症，还使老鼠的骨量增加。”
该研究发表于 2013 年的Journal of cellular physiology杂志，其研究结果表明即使在健康的小鼠中，骨密度也会受到肠道炎症的影响，因此，抑制炎症可能是一种增强骨骼强度的方法1。
这项研究让 McCabe 和 Britton 有了这样的想法：微生物组在调节骨密度方面有一定的作用。
为了验证该想法，他们在雌激素缺乏的老鼠身上测试了罗伊氏乳杆菌。该小鼠是一种绝经后骨密度下降的模型。他们发现，这种疗法再次阻止了老鼠骨密度下降2。
从那以后的几年里，McCabe 一直致力于解开肠道细菌与炎症信号和骨转换之间的联系。和她一起的还有其他研究者们，他们也在跟踪这些联系并尝试各种方法来干预与年龄相关的骨质流失。
④ 微生物组与骨骼的“沟通”
埃默里大学（Emory University）的 Roberto Pacifici 是骨免疫学领域的佼佼者，主攻免疫系统和骨骼之间的关系。多年来，他一直致力于验证一个假设：绝经期雌激素的缺乏会激活骨髓中的 T 细胞，从而导致肿瘤坏死因子（TNF）和其它炎性细胞因子的生成，进而促进骨组织释放钙的分解，也就是骨吸收过程，最终造成骨质流失。
Pacifici 知道一定存在一种抗原能激活 T 细胞，但他无法找到究竟是什么抗原。直到 2012 年，他在一篇论文中看到在无菌环境中长大的老鼠骨密度更高。Pacifici 说：“当我看到那篇文章时，我想，‘啊！这种抗原一定是由微生物提供的。”
为了探究微生物组是否就是缺失的那一环，Pacifici 的研究小组开发了一种缺乏雌激素的无菌小鼠模型。与他的猜测一致，老鼠没有像缺乏雌激素而拥有完整微生物组的动物那样发生骨质流失。
该研究于 2016 年发表在JCI杂志上3。在这项研究中，研究人员还发现，雌激素缺乏会导致肠道细菌及其产物的渗透性更高。这些泄露出来的物质似乎能够激活免疫细胞，然后免疫细胞会进入骨髓，过度产生细胞因子，最终导致骨质流失。
Pacifici 说：“我被震住了，这一刻，我发现了一些我以前从未想过，但却似乎合理的事情。”
McCabe 的研究还表明，强大的肠道屏障对避免骨质流失至关重要。肠道内的细菌内毒素、代谢物或维生素外泄会触发炎症信号，导致骨质流失。而且肠道内的免疫细胞还会监测肠道损伤，然后向骨髓发出警报，从而加速破坏骨骼的免疫反应。
McCabe 说：“我认为我们会逐步发现有多种因素参与了该过程。”
南卡罗莱纳医科大学（Medical University of South Carolina）的 Chad Novince 正在研究微生物组在骨骼成熟过程中的作用，他发现了微生物组与骨骼之间的另一种沟通方式：肠-肝-骨轴。
2017 年，Novince 和他的团队发表了一项研究4，在该研究中，研究人员发现从微生物组中剔除了特定病原体的健康年轻成年小鼠的骨量比无菌小鼠少，而且这些小鼠的肝脏的免疫活动也增强了。
通过一系列实验比较了这两种老鼠类型之间的差异，Novince 和他的团队得出结论：肠道微生物或它们产生的代谢物通过肠道粘膜屏障进入循环，在循环中，它们进入肝脏，激发先天和适应性免疫反应，抑制骨形成，同时促进骨吸收。
导致组织丢失的骨内分子触发机制尚未完全确定，但 McCabe 和 Pacifici 已经分别独立发现，信号分子 Wnt10b 是一个重要因素，它对骨形成至关重要，并由免疫细胞传递到骨。
与此同时，McCabe 和她的同事 Narayanan Parameswaran 以及 Novince 发现了一种调节骨吸收的重要分子 RANKL，并对它进行了研究。
康奈尔大学（Cornell University）生物力学研究员Christopher Hernandez 及其同事还发现，微生物产生的维生素 K 可能会直接影响骨骼的形成。
在 2017 年发表的研究结果中5，他们发现，早期肠道菌群发生改变的小鼠其骨骼比对照组小鼠更脆弱。2019 年发表的一项针对动物肠道菌群的宏基因组学研究进一步发现，两种小鼠产生维生素 K 的基因存在差异6。
Hernandez 猜测维生素 K 会进入骨骼，然后骨钙素等依赖维生素 K 的分子会利用它来构建骨骼。
他表示：“我们现在的研究阶段正处在这些机制影响骨骼的最开始阶段。”
⑤ 益生菌是否会防止骨质流失？
在发现缺乏雌激素的老鼠体内的微生物和骨质流失之间的联系后，Pacifici 研究小组的研究人员进行了下一步的研究，探究调控微生物组是否有助于保护骨骼。
他们给小鼠喂食广泛使用的益生菌株——鼠李糖乳杆菌 GG（Lactobacillus rhamnosus GG）或七种细菌的组合，结果显示，在这两种情况下，益生菌都能缓解雌激素缺乏动物的骨骼流失问题。
Pacifici 说：“细菌的选择并没有太多的科学依据，只是因为这些细菌恰好很受欢迎。我认为给予的益生菌数量是非常重要的，可能比采用什么益生菌更重要。”
一些小型临床研究探究了小鼠实验的结果是否适用于女性。
例如，瑞典的一个研究小组 2018 年发表了一项研究结果7，他们把年龄较大、骨密度较低的女性分为两组，实验组服用 McCabe 和 Britton 研究了一年的罗伊氏乳杆菌（L. reuteri），对照组每天服用安慰剂，结果显示，服用益生菌的女性骨密度的损失较低。
关于该研究《热心肠日报》做过相关报道：
罗伊氏乳杆菌有望减轻老年女性骨质疏松
Journal of Internal Medicine——[6.051]
① 一项随机双盲安慰剂对照试验中，90名75-80岁的女性随机分入益生菌组和对照组，前者每天补充10^10 CFU的罗伊氏乳杆菌ATCCPTA 6475持续12个月；② 70名受试者完成研究，意向治疗（ITT）和符合方案（PP）分析均显示，胫骨总体积骨密度的损失在益生菌组中减少了约一半；③ 次要结局指标在PP集中也存在相似但更小的效果，在ITT集中未达统计学显著；④ 两组间的不良事件无明显差异；⑤ 需进一步验证该益生菌用于预防衰老相关骨质疏松的有效性和机制。
Lactobacillus reuteri reduces bone loss in older women with low bone mineral density - a randomized, placebo-controlled, double-blind, clinical trial
2018-06-21,doi:10.1111/joim.12805
【主编评语】动物研究表明，肠道菌群参与骨代谢调控，给小鼠补充罗伊氏乳杆菌ATCCPTA 6475可增加骨密度。Journal of Internal Medicine近期发表一项RCT，在老年女性中初步证实补充该益生菌可显著减少骨质流失。未来需更大规模的临床试验进一步验证，并搞清相关机制。（@mildbreeze）
几年前，普渡大学（Purdue University）的 Connie Weaver 及其同事报告称8，一种公认的共生微生物食物的益生元——可溶性玉米纤维能够延缓绝经后骨质流失的正常速度。
Weaver 说：“我很惊讶，因为我以为一旦他们开始发生骨质流失，我们就无法进一步保护他们。”韦弗发现，在年轻人中，补充玉米纤维也会导致骨密度指标——骨骼钙含量的增加。
Weaver 认为，可能是由于益生元可以刺激短链脂肪酸的产生，而短链脂肪酸会触发一条最终生成骨骼的途径。
Pacifici 的团队最近在健康老鼠身上的发现了支持这一假设的机制9。该研究的结果证明了下述模型：乳酸菌产生乳酸，而乳酸为共生的梭菌提供养分，然后这些梭菌能够产生短链脂肪酸丁酸盐，进而促进骨生成，增加骨量。
关于该研究《热心肠日报》做过报道：
Immunity：益生菌LGG如何促进小鼠骨生成？
Immunity——[21.522]
① 口服鼠李糖乳杆菌GG（LGG）可使小鼠肠道中产生丁酸的梭菌纲丰度上升，提高肠道和血液丁酸浓度，进而促进骨生成，增加骨量；② 无菌小鼠试验证实该作用依赖于肠道菌群及其产生的丁酸；③ 补充LGG或丁酸，可使小鼠肠道和骨髓中调节性T细胞（Treg）增多，而减少Treg可消除LGG和丁酸对骨生成的促进作用；④ 骨髓中Treg可促进CD8+T细胞中NFAT1-SMAD3转录复合体与Wnt10b启动子结合，增加Wnt10b分泌，进而活化成骨细胞的Wnt信号通路，刺激骨生成。
The Microbial Metabolite Butyrate Stimulates Bone Formation via T Regulatory Cell-Mediated Regulation of WNT10B Expression
2018-11-13,doi:10.1016/j.immuni.2018.10.013
【主编评语】小型临床试验显示，补充特定益生菌可减少骨质流失（https://www.mr-gut.cn/papers/read/1047826041），但机制不清。Immunity本周上线的一项小鼠研究，发现鼠李糖乳杆菌GG（LGG）可作用于肠道菌群，增加短链脂肪酸丁酸生成，使调节性T细胞增多，刺激骨髓中CD8+ T细胞分泌Wnt10b，进而促进年轻小鼠骨生成。这些发现提示补充LGG和丁酸，或能用于预防和治疗骨质疏松，期待大规模临床试验对此进行验证。（@mildbreeze）
虽然上述结果为我们利用益生菌或饮食干预延缓骨质疏松奠定了基础，但是 McCabe 说，还需要更多的临床研究来确定这些手段是否能够治疗疾病或防止正常的骨质流失。
不过，她对该领域的发展持乐观态度。她说：“我很高兴我们都在不同的地方找到了相同的结果，这加强了临床转化的能力。”
随着科技的进步，再也不是单学科线性或两学科二维的发展，而是多学科多维的综合发展，这种模式的转变有助于创新发展。而如何把研究得到的新结论临床化再产业化是值得我们思考的另一问题。
参考文献：
1.McCabe L R, Irwin R, Schaefer L, et al. Probiotic usedecreases intestinal inflammation and increases bone density in healthy malebut not female mice[J]. Journal of cellular physiology, 2013, 228(8):1793-1798.
2.Britton R A, Irwin R, Quach D, et al. Probiotic L. reuteritreatment prevents bone loss in a menopausal ovariectomized mouse model[J].Journal of cellular physiology, 2014, 229(11): 1822-1830.
3.Li J Y, Chassaing B, Tyagi A M, et al. Sex steroiddeficiency–associated bone loss is microbiota dependent and prevented byprobiotics[J]. The Journal of clinical investigation, 2016, 126(6): 2049-2063.
4.Novince C M, Whittow C R, Aartun J D, et al. Commensal gutmicrobiota immunomodulatory actions in bone marrow and liver have cataboliceffects on skeletal homeostasis in health[J]. Scientific reports, 2017, 7(1):1-18.
5.Guss J D, Horsfield M W, Fontenele F F, et al. Alterationsto the gut microbiome impair bone strength and tissue material properties[J].Journal of Bone and Mineral Research, 2017, 32(6): 1343-1353.
6.Guss J D, Taylor E, Rouse Z, et al. The microbial metagenomeand bone tissue composition in mice with microbiome-induced reductions in bonestrength[J]. Bone, 2019, 127: 146-154.
7.Nilsson A G, Sundh D, B?ckhed F, et al. Lactobacillusreuteri reduces bone loss in older women with low bone mineral density: arandomized, placebo‐controlled, double‐blind, clinical trial[J]. Journal ofinternal medicine, 2018, 284(3): 307-317.
8.Jakeman S A, Henry C N, Martin B R, et al. Soluble cornfiber increases bone calcium retention in postmenopausal women in adose-dependent manner: a randomized crossover trial[J]. The American journal ofclinical nutrition, 2016, 104(3): 837-843.
9.Tyagi A M, Yu M, Darby T M, et al. The microbial metabolitebutyrate stimulates bone formation via T regulatory cell-mediated regulation ofWNT10B expression[J]. Immunity, 2018, 49(6): 1116-1131. e7.
参考资料和编译来源：
1.https://link.springer.com/article/10.1007/s00223-017-0331-y
2.https://www.the-scientist.com/news-opinion/bone-and-the-microbiome-have-a-brittle-relationship-66116
