速冻的微观世界
——走近诺贝尔奖(二十一)
如果能看清生物分子的模样，掌握它们的活动规律，那么许多困扰人类的生理机制和疾病就会迎刃而解。冷冻电镜就是一种可看清生物分子的重要工具，它让生物分子的成像变得更简单和清晰，令生物化学研究进入了一个新时代。
自古以来，人类的好奇心不断地推动着社会进步。在好奇心的驱使下，人类不仅把目光投向数万光年之外的星空，也把视野推进到微纳尺寸的微观世界。对生命的细节看得越仔细，就越有利于人们知晓生命的本质。正是在这样的背景下，显微技术成为热门的科研领域，相关科学家也多次荣获诺贝尔奖。瑞士科学家雅克·杜波谢、美国科学家阿希姆·弗兰克、英国科学家理查德·亨德森，也因在冷冻显微电镜领域的突出贡献，而分享了2017年诺贝尔化学奖。
显微镜放大微小样品
如何看清微观世界里的小东西？我们首先想到的就是使用显微镜。原始的光学显微镜是一个高倍率的放大镜。据记载，在1610年前，意大利物理学家伽利略己制作过复式显微镜，并观察了昆虫的复眼。这是一种己具目镜、物镜和镜简等装置，并被固定在支架上的显微镜。
1665年前后，英国生物学家胡克发明了比较类似我们现在学校实验室里用的显微镜，并通过这台显微镜看到了软木中网格状的结构，胡克称之为“细胞”。这是人类历史上最伟大的发现之一，大大推动了生物学的发展。
与胡克同时代的荷兰科学家列文虎克对显微技术的推动做出了主要贡献。他一生制作了不少于247架显微镜，观察了许多细菌、原生动物和动植物组织，是第一个用显微镜做科学观察的人。到18世纪，显微镜已有许多改进，应用比较普遍，已作为一种商品进行生产。
然而，传统的光学显微镜不能无限制地放大微小的样品，它会受到“阿贝原则”的限制。什么是“阿贝原则”？1873年，德国显微镜学家恩斯特·阿贝通过计算发现，由于光波相互干扰的原因，光学显微镜不能无限度地放大微小样品，最多只能“看到”光波波长一半的样品，即尺寸不小于200纳米的样品。这就是有名的“阿贝原则”，200纳米也被称为光学显微镜的“绕射极限”。
如何看清生物大分子
光學显微镜只能看到细胞或细胞内较大的细胞器，要看到100纳米以下的生物大分子就不太可能了。生物大分子是指生物体细胞内存在的蛋白质、核酸、多糖等大分子。每个生物大分子内有几千到几十万个原子，分子量从几万到几百万以上。生物大分子的结构很复杂，但其基本的结构单元并不复杂。蛋白质分子是由氨基酸分子以一定的顺序排列成的长链。氨基酸分子是大部分生命物质的组成材料，不同的氨基酸分子有好几十种。生物体内的绝大多数酶就属于蛋白质，是生物体维持正常代谢功能所不可缺少的。
为了突破光学显微镜的局限，弄清楚生物大分子的构造，科学家想了很多办法。有的科学家制造出超高分辨率光学显微镜，其实是让生物分子发荧光，这种方法的使用有一些局限性。因为它是用激光来激发生物大分子，这样照射时间不能太长，否则可能杀死生物大分子。但是，照射时间短又可能会失去一些重要信息。而且，超高分辨率光学显微镜最高只能达到10纳米的分辨率，仍然无法看清分子内部的精细结构。
还有一种很常用的方法是“x射线晶体衍射”技术。之前，亨德森就非常喜欢用这种技术来研究生物大分子。但是，这种技术也有很明显的局限性，那就是这种方法需要首先获取纯度很高的生物大分子晶体。而不少生物大分子结晶情况不理想，甚至有的就不能结晶。膜蛋白就是一个很大的挑战。对于大多数的生物，膜蛋白占了蛋白质组的20%～30%，药物靶点的达到40%以上。然而，这些分子的结构很少能通过X射线晶体学来阐明。
科学家还想到的方法是用电子显微镜（简称电镜）。电镜的分辨率的确很高，可以达到纳米级以下，看清生物大分子是没啥问题了。电子的波长是光子波长的十万分之一左右，就像一根极细的探针，理论上它打在蛋白质分子等生物大分子身上能被反射，这些反射的电子就能产生一张照片，这就是电镜的基本原理。这也是电镜能比光学显微镜分辨率高得多的原因。
起初，电镜是在材料科学领域中使用的，主要是用其高分辨率来解析材料的结构。电镜在材料科学上的应用遥遥领先于在生命科学上的应用。直到1947～1961年，生物学家才借鉴材料科学中的重金属染色技术，利用电镜技术观测到了许多细胞亚显微结构，如叶绿体、线粒体、核糖体，等等。然而，电镜的局限性也很明显，那就是不能看到活生生的生物大分子。因为电镜需要在高真空条件下工作，而生物样品的含水量很高，水分的挥发使整个样品无法保持真空。另外，电镜的电子携带的能量很高，会把细胞“残忍地烧死”。这样一来，生物学家就难以研究分子在活细胞中的正常活动。
速冻凝固生命细节
为了让电镜也能看到活细胞内的生物分子，科学家想了很多办法。最终想到的办法就是速冻。这就好比科幻小说中的冷冻休眠，把活人速冻之后，人体组织和细胞进入几乎没有活动的休眠状态。多年以后，采用合理的方法解冻，人体又活过来了。也就是说，速冻的细胞虽然几乎不能活动，但是它们的的确确具有生物活性。
在冷冻电镜中，生物大分子被迅速冷冻，使得标本内部和周围的水被固定为玻璃态，以防止晶体的形成。玻璃态——一种看上去是固体，但其分子排列是无序的形态，所以是不折不扣的流体。为什么是玻璃态而不是冰（晶体）呢？首先，是为了保护生物大分子，冻成冰有可能让生物大分子发生脱水，冰晶也容易伤害生物。其次，冰会衍射电子，从而降低电镜观察的图像质量。
利用電镜向冷冻样本发射电子束，被玻璃态速冻水包裹的生物大分子处于“休眠状态”，不再怕电镜的真空环境，也不怕高能电子来“烧”它。散射后的电子通过一个镜头形成二维且放大的图像，并记录在检测器上。结合从各个角度拍摄的图像并取这些角度的平均值，可以生成生物大分子结构的3D模型。
最早发明冷冻电镜的是亨德森，当时他用X射线晶体衍射技术研究膜蛋白遇到了困境，因为如上文所说，膜蛋白不能结晶。他用液氮冷冻的方法来保护视紫红质蛋白（一种膜蛋白）样品不被电子束摧毁。终于在1975年，第一个非常粗糙的视紫红质蛋白结构发表了出来，图片上可以看出七个跨膜蛋白链。
不过，亨德森所发明的速冻技术比较粗糙，获得的图像也非常模糊。速冻，听起来好像是一件非常容易的事情，不就是快速冷却么？然而，科学家探索了很久才找到合理的方法。1982年，杜波谢找到了一种快速冷冻的方法，使水分子还来不及变成排列整齐的冰晶就被冻成像玻璃一样的物质。
杜波谢发现，虽然水被冷冻之后极易形成冰晶，如六角形的晶体或者立方晶体，但当水被十分迅速地冷冻时（冷冻速度约2.6x105℃/秒），就不会形成晶体，而成为无定形的冰（即“玻璃态”）。将溶液中的生物大分子速冻在玻璃态的水中，就可以在液氮温度下使用电镜进行观察。这奠定了冷冻电镜制样与观察的基本技术手段，标志着冷冻电镜技术的诞生。
不过，杜波谢的冷冻电镜获得的图像的细节还不是很丰富，那些生物分子在照片中都是难以名状的一团团的物体，这一领域的研究者也被戏称为“难以名状学家”（blobologist）。况且，电镜获得的都是二维图像，难以确定生物大分子的三维结构。
1986年，弗兰克找到了合适的解决办法。弗兰克采用的方法是“同向拼图”。他对同一种生物大分子不停地拍照，拍上数万张甚至几十万张。听起来似乎有些吓人，但是对自动化的电镜来说，并非难事。难点在于如何对这些照片进行后期处理。弗兰克开发出一种识别和合成的软件，可以将从数以万计的照片中找到那些朝向相似的生物大分子挑选出来，然后再合成一张清晰的图像，再把不同方向的清晰图像合成起来，就可以得到生物大分子的三维结构了。
我们以常见的CT举个例子。如果医生想看到患者脑组织的三维图像，就需要用x射线从不同的方向扫描脑部，然后通过这些投影反推得到脑部的三维图像。这与冷冻电镜技术的三维重构原理十分相似：如果样品不具有任何对称性，那么就需要沿着物体的不同方向进行投影，再通过反傅里叶变换得到物体的三维图像。
弗兰克发明的方法被学术界称为“单粒子冷冻电镜三维重建”技术。单粒子法就是对分离纯化的颗粒状分子进行结构分析。既可以对有20面对称结构的病毒或螺旋对称结构进行分析，也可以对像核糖体等大的可溶性复合物进行结构分析，还可以对溶解状态的膜蛋白进行分析。
如今，超过90%的冷冻电镜都应用这项技术来分析生物大分子。弗兰克的软件降低了图片分析的门槛，让这项技术拥有了普遍的应用价值。具有里程碑意义的成果是，2013年加州大学旧金山分校的程亦凡、大卫·朱利叶斯等人首次得到膜蛋白TRPV1的近原子级别高分辨率三维结构，结果发表在英国出版的《自然》杂志上。
冷冻电镜的作用
理解生物大分子和大的复合物的反应机制是当今生物学领域里的一项重要目标。而冷冻电镜可以很好地完成这项任务。冷冻电镜的优势在于能够在尽可能接近其天然形态的水合状态下观察大分子。这种在原子分辨率下捕获生物分子的图像和结构的能力，将极大地帮助研究人员理解关键的生物过程，并建立结构与功能之间的关联。
长期以来，由于对分子结构的不了解，许多疾病没办法治疗，而如今技术和发明日新月异，意味着我们在将来可以针对很多的疾病，研发出非常有效的药。冷冻电镜技术的进展听上去很简单：分辨率提高到0.35纳米。然而，这意味着我们可以看见原子，看见化学变化的过程，看见原子如何排列成分子，看见病灶的组织结构如何改变。未来，或许我们还将看见某种药物可以阻止大脑衰老。
冷冻电镜技术在帮助医生了解细胞变化过程和发病机理上发挥了重要作用，并且有助于药物开发。例如，在寨卡病毒的研究中，病毒结构解析就起了重要作用。2016年以来，寨卡疫情引起了全世界的关注。这种由伊蚊传播的病毒与出生缺陷以及神经系统自身免疫疾病存在关联。冷冻电镜成功地观测到寨卡病毒的结构，这是传统电子显微镜无法做到的，也是这项新技术实际应用的一个很好的例子。
目前，冷冻电镜分辨率已经很高，可以获得生物大分子的原子结构。如今，科学家还在进一步努力提高冷冻电镜的分辨率，以便揭示更多蛋白的结构和功能。从而更好地了解细胞变化过程、发病机理并开发治疗手段。（责任编辑 张虹）
作者：杨先碧
来源：《 大自然探索》
